201098. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyűrűs peptidek, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
15 HU 201098 B 16 1530 cm-1: araid II 1505 cm"1: tirozin 1248 cm'1: szulfát 3. példa Tyr (SO3H )-Met-Gly-Trp-Glu-Thr( SOsH )-N-mel________________________1 til-Phe-NHz előállítása 5,0 g (1 millimól), az 1. példában leírt módon előállított Boc-N-raetil-fenil-alanin gyantát az 1. példában ismertetett eljárás szerint szekvenciális szilárdfázisú szintézisnek vetünk alá. Az összes kapcsolást a korábban leírt módon, a Boc-aminosavak szimmetrikus anhidridjeinek felhasználásával végezzük el. A 16. és 20. lépés sorén az aktivált aminosavakat a megfelelő alábbi reakcióidőkkel adjuk hozzá: hat különálló ciklust végzünk, éspedig Boc-O-benzil-treoninnal (1,5 g 5 millimól, 60 perc; 1,5 g 5 millimól, 60 perc); Boc-glutaminsav-y-benzil-észterrel (1,6 g, 5 millimól, 30 perc; 1,6 g 5 millimól 30 perc); Boc-N1-formil-triptofánnal (1,7 g 5 millimól, 30 perc; 1,7 g 5 millimól, 30 perc); Boc-glicinnel (900 mg, 5 millimól, 30 perc; 900 mg, 5 millimól, 30 perc); Boc-metioninnal (1,25 g, 5 millimól, 30 perc; 1,25 g, 5 millimól, 30 perc); és Boc-2,6-diklór-benzil-tirozinnal (2,2 g, 5 millimól, 30 perc; 2,2 g, 5 millimól, 30 perc). A Boc-védócsoport lehasítását az 1. példában leirt módon végezzük el és 5,80 g heptapeptidil-gyantát kapunk 2,4 g gyantát-dimetil-szulfidot, p-krezolt és ditio-etánt tartalmazó hidrogén-fluoriddal kezelünk, a 2. példában leírt módon. A gyantát etil-acetáttal mossuk, 30%-os ecetsavval titráljuk, szűrjük és liofilizáljuk. 452 mg nyers pepiidet kapunk. 100 mg nyers pepiidet preparativ HPLC módszerrel (2,3x30 cm) mikro Bondapack Cis oszlopon tisztítunk. A pepiidet 5-65%-os lineáris gradiens szerint 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel, 8 ml-perc átfolyási sebesség mellett eluáljuk. A kimutatás 280 nm-nél történik. A főcsúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 20 mg (23%) Tyr-Met-Gly-Trp-Glu-Thr-N-metil-Phe-NHz-t kapunk. A termék HPLC szerint homogén és a kívánt aminosav-analízist és MS-t adja. 20 mg (0,02 millimól) lineáris peptidet difenil-foszforii-azid felhasználásával, az 1. példában leírt módon ciklizálunk. 4 mg (21%) Tyr-Met-Gly-Trp-Glu-Thr-N-metil-Phe-NH2-t l--------------------------1 kapunk. A fenti termék HPLC szerint homogén és az alábbi aminosav-analizist adja: Thr 0,90 (1); Glu 1,00 (1); Gly 1,00 (1); Met 0,90 (1); Tyr 0,97 (1); Trp 0,63 (1); az N-metil-Phe-t nem határoztuk meg. A MS a kívánt értéknek felel meg. Összegképlet: C46H57N9O10S, molekulatömeg 928,07. 4 mg Tyr-Met-Gly-Trp-Glu-Thr-N-metil-Phe- I--------------------------1 -NH2-t 5 ml piridinben oldunk és 80 mg piridinium-acetil-szulfát (PÁS) 5 ml piridinnel képzett oldatához adjuk; utóbbi oldatot az 1. példában leírt módon készítjük el. A reakcióelegyet egy órán át 60 °C-on keverjük, majd 2 térfogat ammónium-hidrogén-karbonáttal semlegesítjük és liofilizáljuk. A tisztítást preparativ HPLC módszerrel, az 1. példában ismertetett körülmények között végezzük el. 3,8 g (94%) Tyr(S03H)-Met-Gly-Trp-Glu-Thr(S03H)-N-metil-Phe-NH2-t kapunk. Aminosav analízis: Thr 0,90 (1); Glu 1,04 (1); Gly 1,01 (1); Met 0,85 (1); az N-metil-Phe-t és Trp-t nem határoztuk meg. Összegképlet: C46H57N9O16S3, molekulatömeg 1088,20. (UV-adatok: 0,31 mg peptid 3 ml 0,1 n kálium—hidroxid ban X max 249/250 nm £ 3915 X max 256 nm £ 4125 X max 262/263 nm E 4170 X váll 280 nm E 3915 X váll 287/288 nm E 3516 IR-adatok: kálium-bromidban 3450 cm"1: OH, NH 1730 cm"1: észter-kötés 1630 cm"1: amid, karbonil 1200 cm"1: szulfát 4. példa In vitro receptor kötődési teszt Fagyasztott szarvasmarha striatumot (kb. 5 g) és friss patkány pankreászt Xkb. 5 g) a zsirtól és a külső szövettől megtisztítjuk és HEPES 1. pufferrel homogenizáljuk (10 millimól HEPES, 130 millimól nátrium-klorid, 5 millimól magnézium-klorid, pH 7,4), 35 rész puffer (1 rész szövet arányban, nedves tómeg/térfogat-alapon (kb. 175 ml). A szövetet 2x15 mp-ig homogenizáljuk, 0 °C-on Polytron-homogenizátorban, ülepedési érték 6. A szövetet 0 °C-on centrifugálással 10 percig izoláljuk (48 000 g mellett). A kapott szövet pelletet HEPES 2. pufferben újraszuszpendáljuk [10 millimól HEPES, 130 millimól nátrium-klorid, 5 millimól magnézium-klorid, 1 mg/1 fenil-metánszulfonil-klorid (PMSF), 200 mg/1 bacitracin]; 1 rész striatalis szövet (eredeti nedves tömeg) per 80 rész puffer és 1 rész pankreész szövet (eredeti nedves tömeg) per 70 rész puffer arányban. Az inkubálást oly módon indítjuk be, hogy különböző koncentrációjú természetes CCK-8-t vagy (1) képletű peptidet 3H-CCK-8-(S03H)-val (végső koncentráció = 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
