201098. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyűrűs peptidek, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 201098 B 10 lens Boc-aminosav és 5 ekvivalens DCC felhasználásával végezzük el. A kapcsolási reakciókat Kaiser-féle ninhidrin-teszttel követjük nyomon és meghatározzuk, hogy a kapcsolódás a 19. lépés után teljes-e [Kaiser E. és tsai: Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970)]. A teljes ciklus-idó 54-160 perc/aminosav b.) A lineáris pepiid eltávolítása a gyantáról és tisztítás preparatív HPLC útján A teljesen kialakított peptid-gyantákat nagyvákuumban egy éjjelen át szárítjuk. A védócsoport eltávolítását és a lehasitásokat Tam és tsai: [Tetrahedron Letters 23, 4435- -4438 (1982)] a CCK-8 analógokra optimalizált általános módszerének módosított körülményei között végezzük el. A peptid-gyantát teflon HF készülékben (Peninsula) hidrogén-fluoriddal, dimetil-szulfiddal és p-krezollal (5:13:2) egy órán ét 0 °C-on kezeljük, majd kis térfogatra bepéroljuk és a reakcióedénybe friss vízmentes hidrogén-fluoridot (18 ml) desztillálunk be, ezt a második kezelést másfél órán át 0 °C-on végezzük. Alapos bepárlás után a száraz gyantát 3-3 térfogat Et20-al és EtOAc-al mossuk, majd 4x15 ml 30%-os ecetsavval titráljuk és szűrjük. A vizes szűrlet liofilizálása után nyers lineáris peptidet kapunk. A preparatív tisztítást közvetlenül a nyers peptiddel HPLC módszerrel (2,3x30 cm) mikro. Bondapack Cis vagy (2,5x50 cm) Whatmann ODS-3 oszlopon végezzük el. A peptideket minimális térfogatú 50%-os AcOH-ban visszük fel és 5-65%-os lassú grádiens szerint (4 óra) 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel, 8,0 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. A frakciókat háromperces időközökben gyűjtjük össze és analitikai HPLC meghatározás után egyesitjük. A 97%-osnál nagyobb tisztaságú frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. A peptidek tisztaságát HPLC segítségével határozzuk meg; minden esetben 99%-os tisztaságot mértünk. Az egyes peptidek aminosav-analizisét elvégeztük és minden esetben a vért értéket kaptuk. Az analógok UV, IR és MS értékeit meghatározzuk és ily módon is igazoljuk a peptidek kémiai szerkezetét. c.) A lineáris peptidet ciklizáló szerrel kezelve amid-kötésen keresztül, majd HPLC tisztítás útján gyűrűs peptidet kapunk. A lineáris peptidet DMF-ben oldjuk és 3 n sósav/dioxán eleggyel kezelve a szabad aminocsoportot hidroklorid só alakjában protonáljuk. A sót difenil-foszfenil-aziddal kezeljük és egy órán ét -20 °C-on aktiváljuk. A reakcióele gyet DMF-el (15 térfogat) hígítjuk és a pH-t N-metil-morfolinnal 7,5-re állítjuk be. A ciklilzéciós reakciót 2 napon át +5 °C-on végezzük el és ez alatt a pH-t ellenőrizzük és N-metil-morfolin hozzáadásával semleges értéken (pH=7,4) tartjuk. A szerves oldószerben a .pH-t' oly módon határozzuk meg, hogy az oldat aliquot részét megnedvesített keskeny pH-papírcsíkra visszük fel. A gyűrűzárás előrehaladását a reakcióelegy aliquot részének HPLC analízisével követjük nyomon. A kiindulási lineáris peptid 1-2 nap után általában ciklikus monomerré vagy a lineáris peptid polimer formájává alakul. A kapott nyers gyűrűs peptidet preparatív HPLC módszerrel (2,3x30 cm) mikro Bondapack Cis oszlopon tisztítjuk. A peptideket minimális térfogatú ecetsavban visszük fel és 5-65%-os lassú gradiens szerint (4 óra) 0,022% TFA/CH3CN elegyekkel 8,0 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. A frakciókat háromperces időközökben gyűjtjük össze és HPLC analízis után egyesítjük. A gyűrűs peptidek tisztaságát analitikai HPLC, aminosav-analízis és MS meghatározásával mérjük. d.) A gyűrűs peptidek szulfatálása és HPLC tisztítása A kénsavészter-csoportot tartalmazó peptideket a hidroxilcsoportok (tirozin, szerin, treonin vagy hidroxi-prolin) kettős szulfatálásával, piridin-acetilkénsav reagens felhasználásával állítjuk elő. A tipikus szulfatálást a következőképpen végezzük el: 60-240 mg piridinium-acetil-szulfátot (PÁS) 5 ml piridinben oldunk és 60 °C-on 10 percen ét keverjük. 10 mg N-acetil-CKK-8 analógot 5 ml piridinben oldunk, amelyhez a PÁS reagenst hozzáadjuk. A reakcióelegyet 60 °C-on 45-60 percen át melegítjük és keverjük, majd 2 térfogat 0,05 mólos ammónium-hidrogén-karbonáttal semlegesítjük, liofilizáljuk és HPLC tisztításnak vetjük alá. A szulfátéit peptideket preparatív fordítottfézisú HPLC úton tisztítjuk; Cis-10 p (ES Industries) (1,25x30 cm) oszlopon 10-40%-os 2 órás gradiens szerint, 0,05 mólos ammónium-hidrogén-karbonót és acetonitril elegyeiben, átfolyási sebesség 5 ml/perc, kimutatás 240 nm-nél. Az összegyűjtendő frakciók meghatározása és a peptid-tisztaság mérése analitikai HPLC módszerrel, Bondapack Cis, 10 p Waters-oszlopon (0,30x30 cm), acetonitril/ammónium-hidrogén-karbonát gradienssel 2 ml/perc átfolyási sebességgel történik; kimutatás 215 nm-nél. A szulfátéit peptidek tisztaságát analitikai HPLC, aminosav-analízis, UV, IR, MS és NMR segítségével határozzuk meg. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. Az étvágyszabályozó hatású peptideket a fenti eljárás-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
