201096. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok kristályszuszpenziójának és az ezt tartalmazó gyógyszerkészítményeknek az előállítására
5 HU 201096 B 6 A kristályosítást az izoelektromos pontnál 1 pH-egységgel alacsonyabb és 1 pH-egységgel magasabb pH-értékek közötti tartományban végezzük, azaz Pj±l. A pH beállítását adott esetben egy puffer (például foszfát, acetát vagy citrát) segítségével végezzük. A kristályosító közeg fenolt, krezolt vagy más hasonló aromás vegyületet tartalmaz. A kristályosítást előnyösen 3 és 27 °C közötti hőmérsékleten különösen 10 és 20 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A szuszpenziót az eljárás során enyhén keverni lehet (például keveröedényben keverve). Az (I) általános képletű inzulinszármazék koncentrációja a kristályosítás előtt 0,2-40 mg/ml, különösen 1-7,5 mg/ml lehet. A kristályokat közvetlenül olyan közegben is előállíthatjuk, amely az injekciós készítménynek felel meg. Ennek megfelelően a steril közeg fenol vagy más aromás vegyület és a cink mellett egy, az izotóniát biztositó anyagot, például nátrium-kloridot, glicerint, továbbá puffert, például nátriumfoszfátot is tartalmazhat. A találmány szerinti kristályszuszpenzió adalékanyagként a) egy vagy több (I) általános képletű inzulinszármazékot oldott és/vagy amorf formában, b) inzulint és/vagy c) proinzulint és/vagy d) C-peptidet oldott, amorf és/vagy kristályos formában tartalmazhat. Ezenkívül olyan segédanyagot is tartalmazhat, amely az inzulinfelszabadulás lassítását szolgálja, így például globint vagy protamin-szulfátot. A kristálynagyságból és annak homogenitásából adódó előnyök mellett a viszonylag alacsony cinktartalom - amely a cinknek a depo-hordozóknak tekinthető koncentrációja alatt van - lehetővé teszi, hogy a találmány szerinti kristályszuszpenziót oldott inzulinnal szabadon keverjük. Ezzel például lehetővé válik, hogy inzulinoldatot inzulin-származék-kristályszuszpenzióval az alkalmazás előtt elegyítsük. A komponensek mennyiségének változtatásával a kapott gyógyszer hatásprofilja optimálisan szabályozható. Ha a kristályok stabilitásához nagyobb cinkkoncentráció lenne szükséges (amint például a cink-inzulin-romboidok esetén), úgy a hozzáadott oldott inzulin-kicsapódna, és gyorsan ható komponensként nem lenne jelen. A találmány szerinti kristályszuszpenziók tehát minden olyan előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek a diabetes mellitus kezeléséhez szükséges. A lassú oldódás elve az inzulinszármazékokkal velejár, és proteinkémiai jelenségből adódik, azaz abból, hogy a fehérjék izoelektromos pontjukon nehezen oldhatók. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy bejelentésünket az itt bemutatottakra korlátoznánk. A kristályosítás során az inzulin gyakorlatilag 100% kitermeléssel kristályosodik. J. példa 40 nemzetközi egység/ml koncentrációjú, kb 10 um nagyságú prizmákból álló, sertés proinzulin tripszines emésztésével előállított sertés inzulin-Arg^^Arg^^OH kristályszuszpenzió Vízben elkeverünk: Sertés inzulin-ArgB3l-ArgB3Z-0H (27,0 nemzetközi egység/mg) 14,8 mg nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 30,0 mg m-krezol 15,0 mg fenol 6,0 mg A pH-t hígított nátrium-hidroxiddal 7,4- -re, a teljes térfogatot pedig vízzel 10 ml-re állítjuk be. Az edényt 18 °C-on enyhén mozgatjuk, és így éles szélű prizma formájú kristályok keletkeznek, amelyek nagyon egyenletesen növekszenek, kb. 10 pm méretűek, és poláros fényben nagyon kis szögtartományban extinkciót mutatnak. A kristályok nagyságbeli eloszlását Coulter Counter-ben mérjük. A görbe (lásd ábrát) különösen egyenletes nagyságbeli eloszlást mutat, amely főleg 5 és 10 pm átmérőnek felel meg (golyó formájú részecskékre vonatkoztatva). 2. példa 50%, géntechológiai úton előállított preproinzulin tripszines hasításával nyert humán inzulin-ArgB3l-OH és 50%, sertés inzulinból félszintetikus úton előállított humán inzulin-B30-kolinészter elegyének kristályosítása 40 nemzetközi egység/ml készítmény formájában, és ennek lassított hatása Vízben elkeverünk: humán inzulin-ArgB31-OH (27,5 nemzetközi egység/mg) 7,3 mg humán inzulin-(B30)-kolinészter (28,0 nemzetközi egység/mg) 7,1 mg nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 21,0 mg m-krezol 15,0 mg fenol 0,6 mg glicerin 16,0 mg A pH-t hígított nátrium-hidroxiddal 7,0- -ra, és a teljes térfogatot vízzel 10 ml-re állítjuk be. Az edényt szobahőmérsékleten enyhén mozgatjuk, így kb. 10 pm méretű prizma alakú kristályok képződnek. Ez a szuszpenzió 4,0 NE/kg adagolásban nyulaknál erősen lassított hatást mutat. A vércukor szint a kezdeti érték%-ában a következő (12 állat esetén). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
