201093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropin szolubilizálására és kinyerésére
9 HU 201093 B 2. Táblázat 10 Reprezentatív szomatotropinok aminosav-összetétele Aminosav Humán Bovin Ovin Porcin Avian Aszparaginsav 11 10 10 10 11 Aszparagin 9 6 6 5 9 Treonin 10 12 12 8 11 Szerin 18 13 13 15 11 Glutaminsav 14 13 13 13 12 Glutamin 13 11 11 12 10 Prolin 8 6 6 7 9 Glicin 8 10 9 8 7 Alanin 7 14 14 17 12 Valin 7 6 7 7 8 Metionin 3 4 4 3 4 Izoleucin 8 7 7 6 6 Leucin 26 27 27 26 26 Tirozin 8 6 6 7 8 Fenilalanin 13 13 13 13 11 Hisztidin 3 3 3 3 4 Lizin 9 11 11 11 14 Arginin 11 13 13 12 12 Triptofán 1 1 1 1 1 Cisztein 4 4 4 4 4 (E. coli K 12, W3110/pBGH-l törzs), amint ez 30 a 75,444A számú európai szabadalmi közzétételi irat ismerteti; porcin szomatotropint, amint ezt a 111,389A számú európai szabadalmi közzétételi irat ismerteti; és avian szomatotropint, amint ezt a VJ084/Ü1150 számú PCT 35 közzétételi irat ismerteti. A jelen találmány céljaira a fénytöró testecskéket standard bilógiai technikákkal lehet kinyerni. Így pl. a gazdasejteket, amelyeket előzőleg toluolra és fenolra egyaránt 40 0,25 súly %-os oldattal öltünk el, általánosan használt mechanikai eszközökkel, pl. Manton-Goulin homogenizátorral vagy francia préssel összezúzzuk. Előnyös, ha az ósszezúzás folyamatát úgy hajtjuk végre, hogy a gazda- 45 szervezetből származó sejttörmelék megfelelően legyen összezúzva ahhoz, hogy kis sebességű centrifugálásnál a homogenizált oldatból az üledékbe kerüljön. Kis sebességű centrifugólásnál a fénytörő testecskék kiülepednek 50 a homogenizált állatból. A fénytörő testecskéket előnyösen újra szuszpendáljuk, mossuk és ismét centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük, viszonylag tiszta készítményt nyerve. Bár a jelen találmány szempontjából nem kri- 55 tikus, előnyös, ha a fénytörő testecske készítményt még egyszer homogenizáljuk, hogy szabadon diszpergált készítményt biztosítsunk, amely mentes az agglomerált fénytöró testecskéktől. A készítményt előnyösen Man- 60 ton-Goulin homogenizátorban homogenizáljuk 3000-5000 psig-nél (-20,3 - 33,9 MPa). Bár korábban beszámoltak arról, hogy a karbamid hatásos ágens egyes fehérjék .kigöngyőlités'-ére (denaturálására) és több 65 egységből álló fehérjék disszociálására alegységeikké, most azt találtuk, hogy - a korábbi kitanitásokkal ellentétben - a szomatotropinokat hatásosan lehet szolubilizálni a gazdasejtek fénytöró testecskéiből is, ezeket a fénytöró testecskéket hatásos mennyiségű és koncentrációjú karbamid hatásának téve ki. Nyilvánvaló lesz majd az alábbiakból, hogy a karbamid hatásos szolibilizáló ágens adott koncentrációknál és pH-nél. Egy másik változat szerint a vízben oldott alkalikus dimetilszulfont is hatásosnak találtuk a szomatotropinok szolubilizálására fénytöró testecskék bői. A szükséges karbamid vagy a dimetil-szulfon koncentráció függ a pH-tól, a szóban forgó szomatotropintól, a szolubilizálandó fehérje mennyiségétől. A karbamid vagy dimetil-szulfon alkalmazása gazdaságilag kedvező, mivel ezek könnyen rendelkezésre állnak, viszonylag olcsók, ökológiailag biztonságosabbak, mint az erős kaotróp ágensek, és lényegében nem lépnek kölcsönhatásba a továbbiakban következő tisztítási lépésekkel. A magyarázat tisztasága és tömörsége érdekében a következő leírást a karbamid alkalmazását hangsúlyozva adjuk meg. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerhetik azonban, hogy az azonos tipusú folyamati paraméterek, (pl. koncentráció, abszolút mennyiség, pH, hőmérséklet, stb.) azonos módon hatnak a dimetil-szulfónnal mórt eredményekre is, lásd pl. a 13. példát. A szomatotropin fehérjéket tartalmazó E. coli fénytöró testecskéket különböző mértékben lehet szolubilizálni 8 mól/liter és 7
