201093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropin szolubilizálására és kinyerésére
1 2 HU 201093 B A találmány tárgya új eljárás szomatotropin szolubilizálására és kinyerésére. A rekombináns DNS technológia lehetővé teszi heterológ fehérje kifejeződését olyan gazdasejtekben, mint pl. E. coli bakériumok. 5 Arról is beszámoltak, hogy bizonyos heterológ fehérjék, mint a szomatotropinok (növekedési hormonok) elkülöníthetők változó mértékben a kifejeződést követően fénytörő testecskékben a gazdasejt citoplazmáján belül. 10 Kaotróp ágenseket, mint pl. guanidin-hidrokloridot, nátrium-tiocianátot, karbamidot és különböző detergenseket alkalmaznak a nem kovalens intermolekuláris vonzások széttörésére a fehérjéken belül. így pl. ki- 15 mutatták, hogy a fehérjéket ki lehet .göngyölíteni’ olyan módon, hogy a fehérjéket kaotróp ágensek hatásának teszik ki lásd: Stryer: Biochemistry (2. kiadós, 1981), 34-35. oldal, kiadó: W.H. Freeman and Company. Ha- 20 sonlóképpen kimutatták azt is, hogy azokat a fehérjéket, amelyek több alegységet tartalmaznak, megfelelő alegységeikre lehet disszociálni kaotróp ágensekkel. Nemrégiben közölték a 114,506A európai 25 szabadalmi közzétételi iratban, hogy heterológ fehérjéket szolubilizalni lehet fény törő testecskékből erős kaotróp ágenseket, mint pl. guanidin-hidrokloridot, detergenseket, mint pl. nótrium-dodecil-szulfátot, és tiocia- 30 nátok sóit alkalmazva. A karbamidnak, amely viszonylag gyenge kaotróp szer, alkalmazását hatástalannak írták le fénytörő testecskék szolubilizálására. Az erős denaturálószerek, mint pl. a guanidin-hidroklorid, igen drágák. 35 Ezen túl ha egyszer erős denaturólószerrel szolubilizálnak, a heterológ fehérjét ót kell vinni gyenge denaturálószerbe, amely nem lép kölcsönhatásba a később következő, ioncserélőt alkalmazó tisztítási lépésekkel. 40 Következésképpen a jelen találmány tárgya javított módszer szolgáltatása a szolubilizóláshoz és a heterológ szomatotropin fehérjék ezt követő naturálósához a gazdasejt fénytörő testecskéiböl, 45 amely könnyen rendelkezésre álló és viszonylag olcsó ágenst használ, a helyreállítási (naturólási) lépést viszonylag nagy szomatotropin koncentrációnál lehet végrehajtani. 50 A szomatotropin fehérjék szolubilizálását és/vagy helyreállítását redukáló ágensek jelenlétében vagy tóvollétében hajtjuk végre, egyben olyan szert alkalmazunk, amely ökológia- 55 ilag biztonságosabb, mint az eddigi módszerekben alkalmazott ágensek. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a vizes karbamid- vagy dimetil-szulfon-oldatot hatásosan lehet alkalmazni az 60 ilyen szomatotropin-fehérjét tartalmazó fénytörő testecskék szolubilizálására. Meglepő módon azt találtuk továbbá, hogy ha egyszer már szolubilizáltunk, az ilyen szomatotropin fehérjét helyre lehet állítani karbamid- vagy 65 dimetil-szulfon-oldatban, az oldatot érintkezésbe hozva enyhe oxidálószerrel annyi ideig, amely elegendő, hogy diszulfid-hidak képződése legyen az eredmény, amely diszulfid-kötés jelen van a fehérje natív konformációjában. A helyreállitás hatékonyan létrejöhet még nagy fehérje-koncentrációnál is, tisztátalan készítményben és redukálószer tóvollétében. A .szomatotropin' kifejezés jelenthet emlős szomatotropinokat, de nem korlátozódik ezekre, ilyenek pl. a humán-, juh-, sertés- és szarvasmarha szomatotropin, és mások, pl. a madár szomatotropinok. A természetben előforduló szekvenciával bíró fenti szomatotropin-fehérjékhez alkalmas eljárásokon túl a jelen találmány azonos mértékben alkalmazható olyan rendszereknél is, amelyek természetben előforduló fehérjék olyan analógjait foglalják magukban, amelyek szomatotropin-szerű aktivitással bírnak. Azok számára, akik a szakterületen jártasak, érthető, hogy más szomatotropin-szerű fehérjéket, amelyek hasonló kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, mint pl. a prolaktin és a placenta-laktogén, tisztítási szempontból lényegében azonosnak tekinthetjük a szomatotropinok kai. Következésképpen addig a mértékig, ameddig az ilyen fehérjék egyenértékűek tisztítási szempontból, a jelen találmány kiterjed az ilyen fehérjék alkalmazására is. A ..heterológ’ fehérjék olyan fehérjék, amelyeket a gazdasejt normálisan nem termel. A rekombináns DNS technológia lehetővé teszi a heterológ fehérjék viszonylag nagy menynyiségének kifejeződését a transzformált gazdasejtekből. Nem teljesen érthető okokból azonban ezek gyakran oldhatatlan fénytörő testecskékbe záródnak a gazdasejt citoplazmájában. A .fénytörő testecskék ’ azokat a bezárt testecskéket vagy citoplazmás aggregátumokat jelentik, amelyek legalábbis részben a kinyerendő heterológ szomatotropint tartalmazzák. Az aggregátumok fényes foltként tűnnek fel fáziskontraszt-mikroszkóp alatt. A .gazdasejt’ olyan mikrobiológiai sejtet, pl. baktériumot vagy élesztőt vagy más alkalmas sejteket, mint állati és növényi sejteket jelent, amelyek transzformálva vannak, hogy heterológ szomatotropint fejezzenek ki. A gazdasejtek, amelyeket a jelen találmány szerint ennek tekintünk, azok, amelyekben a heterológ szomatotropin elkülönül a kifejeződés után a fényszóró testecskékben. Példa szerinti gazdasejt az E. coli K 12 (W3110/pBGH-1 törzs), amelyet úgy transzformáltunk, hogy lehetővé váljék a bovin szomatotropin kifejeződése. A .helyreállítás’ a szomatotropin fehérje .begöngyölitésére’ (naturálására), és oxidációjára vonatkozik természetes konformációjára, hogy a biológiai aktivitás biztosítva legyen. 3
