201085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfortartalmú vegyületek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 HU 201085 B A találmány szerinti ejárással a szóban forgó vegyületeket előállíthatjuk racem elegy formájában, amelyből azután rezolválással juthatunk az előnyösebb (S)-izomerhez, de eljárhatunk úgy is, amint azt a példákban 5 majd részletesen bemutatjuk, hogy közvetlenül a megfelelő (S)-izomer keletkezzék. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek a (3-hidroxi-3-metil-glutaril)-koenzim A (HMG-CoA) reduktáz inhibitorai, és 10 mint ilyenek, a koleszterin bioszintézisét gátló hatású szerként hasznosíthatók. Ennek bizonyítása az alábbi vizsgálatokkal történt. 1) Patkánymáj HMG-CoA reduktáz 15 A patkánymáj HMG-CoA reduktáz aktivitását az Edwards által leírt módszer [Edwards, P.A. és munkatársai, J. Lipid Res. 20: 40 (1979)] módosított változatával végeztük. 20 A patkánymáj mikroszomális frakcióját használtuk enzimforrásként, és az enzim aktivitását a [14C(HMG-CoA szubsztrát)14C] mevalonsavvá átalakított mennyiségéből határoztuk meg. 25 a) Mikroszómális frakció elkülönítése 2-4 darab kolesztiraminnal etetett, Sprague Dawley patkány fejét a törzsétől el- 30 választjuk, a májakat kioperáljuk, és .A" foszfát pufferoldattal (kálium-foszfát: 0,04 mól, pH = 7,2; kálium-klorid: 0,05 mól; szacharóz: 0,1 mól; etilén-diamin-tetraecetsav: 0,03 mól; aprotinin: 500 kallikrein inaktivátor 35 egység mililiterenként) homogenizáljuk. -A homogenizátumot 16 000 g-vel, 4 °C hőmérsékleten, 15 percig centrifugáljuk, a felülúszót leszívatjuk, és az elsővel azonos körülmények között még egyszer centrifugáljuk. A 40 második centrifugálás során kapott felülúszót ezután 4 °C-on, 70 percen át, 100 000 g-vel centrifugáljuk. Az összetömörült mikroszómákat minimális térfogatú, májanként számítva 3-5 ml .A" pufferoldatban felszuszpendáljuk, 45 és egy üveg/üveg homogenizáló berendezésben homogén szuszpenziót készitünk, amelyhez 10 mmól koncentrációban ditiotreitolt adunk. A preparátumot egyenlő részekre osztjuk, acetonos szárazjégben lefagyasztjuk, 50 és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. Az általunk elkülönített mikroszomális frakció fajlagos aktivitása percenként 0,68 nmól mevalonsav/mg fehérje volt. 55 b) Az enzimaktivitás mérése A reduktáz aktivitását 0,25 ml térfogatban, az alábbi összetevőket tartalmazó közegben mértük (a megadott értékek a végső 60 koncentrációra vonatkoznak): 0,04 mól kálium-foszfát, pH = 7,0 0,05 mól kálium-klorid 0,10 mól szacharóz 65 12 ü,UJ moi e tilén- diamin- te traecetsav 0,01 mól ditiotreitol 3,5 mól nátrium-klorid 1% d imetil-szulfoxid 50-200 /ug mikroszomális fehérje 100 /uniói DL-(14C)HMG-CoA (0,05 pCi, 30-60 mCi/mmól) 2,7 mmól NADPH (nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát) A reakcióelegyet 37 °C-on inkubáltuk. A megadott körülmények között az enzimaktivitás 300 jug mikroszomális fehérje mennyiségig lineárisan növekszik, és ugyancsak lineárisan változik az átalakított szubsztrát mennyisége az idővel, 30 percig. A standard inkubációs idő a vizsgálati anyag esetében 20 perc volt, ez idő alatt a HMG-CoA szubsztrát 12-15%-a alakult át mevalonsavvá. 100 /umól DL-HMG-CoA szubsztrátot alkalmaztunk minden egyes meghatározáshoz, ami az adott körülmények között az enzim telítési koncentrációjának kétszerese. A NADPH-t feleslegben alkalmaztuk, és koncentrációja 2,7-szerese volt annak az értéknek, amely a maximális átalakulási sebesség eléréséhez szükséges lett volna. Az inhibitorhatás kiértékelését az alábbi standardizált mérési eljárással végeztük: A mikroszomális enzimet NADPH jelenlétében, 37 °C hőmérsékleten, 15 percen át inkubáljuk. Ezután hozzáadjuk a megfelelő mennyiségű dimetil-szulfoxidot, amely vagy tartalmazza a vizsgálandó vegyületet, vagy nem, és folytatjuk az inkubálást 37 °C-on további 15 percen ét. Az enzimaktivités mérése a (14C)HMG-CoA szubsztrát hozzáadáséval indul. 20 perc időtartamú, 37 °C-on folytatott inkubálás után a reakciót 25 wl 33%-os kálium-hidroxid hozzáadásával leállítjuk, beadagolunk, 0,05 juCi (3H) mevalonsavat, és szobahőmérsékleten 30 percen át állni hagyjuk az elegyet. Ezután, hogy a keletkezett mevalonsavat laktonná alakítsuk, 15 jul 5N sósavat, majd ezt követően brómfenolkék indikátort adunk az elegyhez, biztosítva ezáltal, hogy a megfelelő pH-csökkenést érzékeljük. A laktonná alakítás időtartama szobahőmérsékleten 30 perc, aminek elteltével az elegyet 15 percen át 2800-as fordulatszámmal centrifugáljuk. A felülúszót ezután egy 2 g AG 1- -X8 anioncserélő gyantát tartalmazó (Biorad, formiét fázisú), 0,7 cm belső átmérőjű oszlopra rétegezzük, és az oszlopot 2 ml vízzel eluáljuk. Az első 0,5 ml eluátumot elöntjük, majd az eztán következő 1,5 ml-t felfogjuk, és 10,0 ml Opti-fluor szcintillációs folyadékban megmérjük mind a trícium, mind a 14- -szén radioaktivitásét. Az eredményt a 20 perc alatt keletkezett mevalonsav nmól-ban kifejezett mennyiségével adjuk meg, amelyet a tricium visszanyeréséből számított értékkel korrigálunk. A vizsgálati anyag hatását Iso értékként (az a koncentráció, amely 50%-os enzimaktivitás csökkenést okoz) adjuk meg, 8
