200939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS technikával előállított hTNF stabilizálására
HU 200939 B 13 1. referencia példa 1. lépés A TNF előállítása nyúl szérumból 2,5-3 kg-os nőstény nyulakat injekciózunk 50 mg formaiinnal elölt Propionibacterium acnes-sel (Corynebacterium parvum, Wellcome Research Laboratories, Anglia) a fül vénáján keresztül. Nyolc nappal később 100 pg endotoxint (Escherichia coli 026:B6-ból származó lipopoliszacharid; gyártja: Difco Laboratories, USA) injekciózunk ismét a fül vénáján keresztül és 2 órával később az összes vért összegyűjtjük a szívből. Az összegyűjtött vérhez heparin-nátriumot adunk 100 egység/ml mennyiségben. A vért azután centrifugáljuk hűtés közben 5000 fordulat/percnél 30 percen át, hogy eltávolítsuk a vörös vérsejteket és az oldhatatlan szilárd részeket. Végül 2,4 liter plazmát nyerünk 40 nyúlból, amely plazma 3.103 4 * egység/ml szérum TNF citotoxikus aktivitással bír. 2. lépés A TNF részleges tisztítása a nyúl szérumból Az 1. lépésben nyert 2,4 liter plazmához 24 g cellitet adunk. Az így létrejött keveréket kevertetjük egy órán át, majd szűrésnek vetjük alá. A szűrletet összekeverjük 1,2 liter 0,04 mól/literes Trisz- HC1 pufferral (pH 7,8), majd DEAE-Sepharose CL-6B oszlopra visszük fel (gyártja és forgalmazza a Pharmicia Fine Chemicals, Inc., Svédország), amely megfelelően ki van egyensúlyozva 0,04 mól/liter Trisz-HCi pufferral (pH 7,8), amely 0,1 mól/liter NaCl-t is tartalmaz. Az oszlopot 0,04 mól/literes Trisz-HCl pufferral mossuk, és az adszorbeált TNF-et 0,04 mól/literes Trisz-HCl pufferral eluáljuk (pH 7,2), amely 0,18 mól/liter NaCl-t is tartalmaz. Az L sejtek ellen citotoxikus aktivitást mutató frakciókat ultraszűréssel koncentráljuk. Az így nyert koncentrátumokat SephacrylS-200 oszlopra visszük fel (gyártja és forgalmazza a Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Svédország), amely megfelelően ki van egyensúlyozva 5 mmól/literes foszfát-pufferral, és gél-szűrésnek vetjük alá ugyanezt a puffert alkalmazva. Az aktív frakciókat ultraszűréssel koncentráljuk, ezáltal olyan tisztított TNF-et nyerünk, amely 3,5.106 egység aktivitással és 18.106 egység) mg fajlagos aktivitással rendelkezik. 3. lépés Anti-TNF antitest A 2. lépésben részlegesen tisztított nyúl szérum TNF-et összekeverjük komplett Freund-féle adjuvánssal 1:1 arányban, majd szubkután injektáljuk 12 hetes BALB/c hímegerek hátába. A fenti műveletet 2 és 4 héttel a kezdeti injekció után megismételjük. Egy héttel az utolsó injekció után az összes vért összegyűjtjük. Az összegyűjtött vérből a szérumot kinyerjük. Az így nyert szérumot hozzáadjuk a tenyésztő tápközeghez a TNF L sejtek elleni citotoxikus aktivitásának értékelésére olyan mennyiségben, hogy ez a végső koncentrációban 500-szorosra legyen hígítva. A nyúl szérum TNF L-sejtek elleni citotoxikus aktivitását azonos módon végezzük, ahogyan ezt korábban leírtuk. Úgy találjuk, hogy a nyúl szérum TNF nem mutat citotoxicitást L-sejtek ellen. A fenti eredményből arra a következtetésre lehet jutni, hogy az ebben a lépésben nyert egér szérum tartalmaz egy antitestet a nyúl szérum TNF ellen (a továbbiakban ezt „anti-TNF-antitest-nek nevezzük). 4. lépés TNF-termelő sejtek előállítása Egy nőstény nyulat injekciózunk intravénásán formáimnál elölt Propionibacterium acnes sejtekkel (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, Anglia). Hét nappal később a nyulat tracheotomiának (légcsőmetszés) vetjük alá, és a tüdőt fiziológiás sóoldattal mossuk, ezáltal lebegő sejteket nyerünk. Az így nyert sejteket fiziológiás sóoldattal mossuk. RPMI 1640-et (Flow Laboratories, Inc., USA) alkalmazva tenyésztő tápközegként, amely még 10% (térf./térf.) borjú-embrió szérumot is tartalmaz, a sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk olyan levegőben, amely 5% széndioxidot tartalmaz. A sejt-tenyészetet két részre osztjuk, és közülük az egyikhez Escherichia Coliból származó endotoxint (Escherichia coli 026:B6- ból származó lipopoliszacharid, gyártja: Difco Laboratories, USA) adunk 10 pg/ml koncentrációban. A másikhoz ugyanilyen mennyiségű steril vizet adunk. A sejttenyészet felülúszója, amelyhez endotoxint adunk, citotoxikus aktivitást mutat L sejtek ellen, és az aktivitás hét órán belül eléri a maximális értéket. Az ilyen aktivitást az anti-TNF antitest eltünteti, míg a normál egér szérum nem tünteti el. Másrészt annak a sejttenyészetnek, amelyhez nem adunk endotoxint, a felülúszója nem mutat citotixicitást L-sejtek ellen. 5. lépés A TNF molekulasúlya A 4. lépésben előállított sejttenyészethez, amelyhez endotoxint is adunk, a továbbiakban radioaktív L-[35S]metionint (1300 Ci/mmól, gyártja: A mersham Industries, plc., Anglia) adunk (1 mCi/ml). Laemmli módszerével összhangban [lásd: Laemmli, U. K. (1970), Nature (london), 227. kötet, 680- 685 oldal] a felülúszót SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel analizáljuk. A gél-koncentrációt 12,5 súly%-ra állítjuk be. Az elektroforézis után a gélt ENHANCE-val kezeljük (a New England Nuclear Inc., USA termékének márkaneve), és szárítás után röntgenfilmre exponáljuk (fuji RX, gyártja és forgalmazza: Fuji Photo Film Co., Ltd., Japán). A sejttenyészet felülúszójában endotoxin jelenlétében megfigyelhető, hogy egy kb 17 500 molekulasúllyal rendelkező anyag képződik. Ezen kívül minden 4. példában készített sejttenyészet felülúszóját SDS-poliakrilamid gél elektroforézisnek vetjük alá azonos módon, amint ezt fentebb leírtuk. Ezután a gélt 2,5%-os NP40-ben (felületaktívszer, forgalmazza: Calbiochem, USA) egy órán át, majd vízben két órán át rázatjuk. A rázatás tuán minden vándorlási sávot elkülönítünk kivágással, és ezeket csíkokká vagdossuk a vándorlás irányával merőleges irányban. Minden csíkot L-sejtekkel tenyésztünk, cs L sejtek elleni citotoxikus 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
