200797. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására
5 HU 200797 B 6 sókleten 30 percen át állni hagyjuk, ezt követően az alább Ismertetett összetételű minimál tápközeggel készült agar lemezre szélesztjük, amely tartalmaz még bóta-naftokinolint is olyan koncentrációban, amely elegendő a szülőtörzs növekedésének gátlására (40 p.g/ml). 30°C hőmérsékleten 3 napon át végzett tenyésztés után a kívánt mutáns törzset a kinövő telepekből elkülönítjük a béta-naftokinolinra való rezisztencia alapján, és ezt Corynebacterium glutamicum H-4412-nek nevezzük. Ez nyilvánvalóan különbözik a H-3149 szülőtörzstől a béta-naftokinolinra való rezisztencia és a nagyobb L-lizin termelékenység szempontjából, amint ezt az alábbi 1. táblázat bemutatja. A minimál tápközeg összetétele (agar lemez): glükóz 10 g/l; NH4CI 1 g/l; karbamid 2 g/l; KH2PO4 1 g/l; K2HPO4 3 g/l; MgS04.7H20 0,4 g/l; FeS04.7H2010 mg/l; MnS04.4H20 4 mg/l; biotin 50 (xg/l; nikotinsav 5 mg/l; ZnS04.7H2Ü 1 mg/l; CuS04.5H20 1 mg/l; (NH4)6Mo7024-4H20 1 mg/l; agar 2% (pH 7,0). 1. TÁBLÁZAT Béta-naftokinolin (ng/ml) 0 30 40 H — 3149 törzs ++ +H — 4412 törzs ++ + + + Megjegyzés: ++ = teljes növekedés; + = gyenge növekedés; ____________- = nincs növekedés 2. példa Corynebacterium glutamicum H-4412-t (FERM BP-1069) 300 ml-es Erlenmeyer lombikban levő oltó tápközegbe (20 ml) viszünk, ahol a tápközeg összetétele az alábbi: 40 g/l glükóz, 3 g/l karbamid, 0,5 g/l K2HPO4, 0,5 g/l MgS04-7H20, 50 mg/l biotin, 20 g/l pepton és 5 g/l élesztőkivonat (pH 7,2). 30°C hőmérsékleten 24 órán át, rázatás mellett (220 fordulat/perc) végzett tenyésztés után a tenyészetet (2 ml) átvisszük 300 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely 20 ml tápközeget tartalmaz, amelynek összetétele: 100 g/l melasz (glükózra számítva), 40 g/l ammónium-szulfát, 0,5 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgS04.7H20, és 30 g/l CaCC>3, majd 32°C hőmérsékleten tenyésztünk 4 napon át rázatás mellett. A tenyésztés befejezése után L-lizin halmozódik fel a tenyószközegben 52 g/l koncentrációban, L—llzin—hidrokloridként számolva (savas réz/ninhidrln reakciót alkalmazó színreakciós módszerrel határozva meg). Összehasonlításként a H-3149 szülőtörzset is hasonló módszerrel tenyésztjük, ahogyan fentebb leírtuk, így 44 g/l L-iizln-hldrokloridot nyerünk. Az így létrejött tény észlevet (1 liter) centrifugáljuk, hogy felülúszót kapjunk. Miután a pH-t kénsavval 1,5-re állítottuk be, a felülúszót kapjuk. Miután a pH-t kénsavval 1,5-re állítottuk be, a felülúszót Diaion SK-1B-vel töltött oszlopon (H+ forma; erősen savas ioncserélő gyanta; a Mitsubishi Kasel Kogyo K.K., Tokio, kereskedelmi terméke) engedjük át, hogy az L-lizlnt a gyantára adszorbeáljuk. Az oszlop vízzel történő mosása után eluálást 2 n vizes ammónia-oldattal hajtjuk végre, ez a művelet L—llzin—tartalmú frakciókat eredményez, amelyeket azután összegyűjtünk, egyesítünk és koncentrálunk. Miután a pH-t 2,0-ra beállítottuk sósavval, a koncentrált oldatot hűtjük, miközben etanolt adunk hozzá; így kristályos L-lizlnt kapunk. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás L-lizin előállítására valamely corynebacterium, Brevibacterlum, Mlcrobacterium vagy Arthrobacter nemzetségbe tartozó, L-lizint termelő mutáns törzs alkalmas tápközegben történő tenyésztésével, és a tápkőzegben felhalmozódott L-lizin kinyerésével, azzal jellemezve, hogy béta-naftokinolinra rezisztens L-lizint termelő mutáns törzzsel fermentálunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentálást 20—40'C hőmérsékleten, 3—9 pH-nál 1—6 nap alatt végezzük. 3. Az 1. vagy 2. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként FERM BP-1069 számon deponált Corynebacterium glutamicum H-4412 jelű törzset alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Rajz nélkül Kiadja: Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr.Szvoboda Gabriella osztályvezető N° 2219. Nyomdaipari vállalat, Ungvár
