200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
7 HU 200795 B 8 cil-szulfáton végzett elektroforézise (SDS/PAGE) után. Ismert molekulasúlyú fehérje-jelzőket (jobb oldali vonal) futtattunk egyidejűleg. Anyagok és módszerek a. ) Enzimreakciók. A restrikciós és DNS módosító enzimeket a New England Biolabs Inc.-töl (Beverly, Massachussets) vagy az International Biotechnologies Inc.-töl (New Heaven, Connecticut) szereztük be. Egy tipikus restrikciós enzim reakciót 50 pl térfogatban hajtottunk végre, követve az enzim szállítójának javasolt eljárásait. A .ragadós’ végű DNS-sel végzett ligálási reakciót tipikusan 15 °C hőmérsékleten hajtottuk végre egy éjszakán át 20 pl pufferolt oldatban, amely. 100-200 ng DNS-t és 400 egység T4 DNS ligázt (N.E. Biolabs) tartalmazott. A tompa végű ligáláshoz 4 egység T4 DNS ligázt (N.E. Biolabs) alkalmaztunk a fenti reakciókeverékben [Goodman, H.M.; és MacDonald, R.J.: Method. Enzymol. 68, 75 (1979)]. Az alkalmazott pufferoldatot 10-szeres törzsoldatként készítettük el: 0,5 mól/liter Trisz-HC1 (pH 7,6), 0,1 mól/1 MgCk és 0,1 mól/1 DTT (ditriotreitol). . b. ) Oligonukleotidok szintézise. Az ebben a bejelentésben említett öszszes oligonukleotidot a foszfotriészter módszerrel szintetizáltuk [Crea és munkatársai: Proc. Nat’l. Acad. Sei. (USA), 75, 5765 (1978)], a Gene Machine 380A modellt (Applied Biosystems Inc., Foster City, California) alkalmazva. Ezek ligálási reakciókban történő használata előtt az oligomereket. 5’ végüknél foszforileztük 50 pl térfogatban, amely 200- -500 ng DNS-t, 10 egység T4 DNS kinázt, 0,5 mmól/1 ATP-t és kináz puffert (0,05 mól/1 Trisz-HCl, pH 7,6, 10 mmól/1 MgCk, 5 mmól/1 DTT) tartalmazott, 37 °C hőmérsékleten inkubálva fél órán át. Hibridizálási vizsgáló mintaként való alkalmazáshoz az oligomereket radioaktiv jelzéssel látjuk el 100 pCi gamma-32p_ATP-vel (5000 Ci/mmól, Amersham, Arlington Heights, Illinois), Maxam, A.M. és Gilbert, W. módszerét alkalmazva [Method.. Enzymol. 65, 499 (1980)]. c. ) DNS fragmensek izolálása. A DNS fragmenseket először elektroforézissel 0,5-1,5%-os agaróz gélen elkülönítettük. Az elektroforézist mintegy 100 Voltnál, 2-4 órán át, trisz-borát-EDTA (TBE) pufferban (0,089 mól/1 trisz, 0,089 mól/1 bórsav, 2 mmól/1 EDTA, pH 8,0) végeztük. A DNS csíkokat UV lámpa alatt tettük láthatóvá, a gélt 0,5 pg/ml etidium-bromid oldatban megfestve [Sharp és munkatársai: Biochem. 12, 3055 (1973)]. A DNS-t tartalmazó agaróz-csikot bo6 rotvapengével kivágtuk. A DNS-t elektroelúcióval kiszabadítottuk a gélből [Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, a Laboratory Manual (Molekuláris klónozás: Laboratóriumi Kézikönyv) 164. oldal /1982/]. A DNS-t tovább tisztítottuk, átengedve egy Elutip-d oszlopon (Schleicher és Schuell, Keene, New Hampshire). A DNS-t etanollal kicsaptuk. Miután Eppendorf mikrocentrifugában 15 percen át centrifugáltunk, az üledéket egyszer mostuk 70%-os etanollal, vákuumban szárítottuk és feloldottuk 50 pl ionmentesitett vízben. d. ) Miniplazmid DNS előállítása. Mintegy 2 ml LB (Luria Bér tani) tápközeget, amely megfelelő antibiotikumokat tartalmazott, inokuláltunk egyedi baktérium-telepekkel, és inkubáltunk 37 °C hömérséklen' egy éjszakén ót élénk rázatás mellett. A tenyésztő tápközeg mintegy 1,5 ml-ét alkalmaztuk plazmid DNS izolálására forralásos módszerrel, amint ezt Maniatis és munkatársai leírták (lásd fentebb idézett munka, 366. oldal). A tenyészet maradékát 15%-os glicerinben tároltuk -20 °C hőmérsékleten későbbi alkalmazáshoz. A DNS-t 40 pl, 10 pg/ml RNÄ-zt tartalmazó H20-ban feloldottuk. Mintegy 8 pl elegendő egy restrikciós enzimes elemzéshez. e. ) Plazmid DNS nagyléptékű előállítása. Tipikusan 1 liter LB tápközeget inokuláltunk egy egyedi baktérium-telepekkel. A plazmid DNS klóramfenikollal végzett sokszorozása után a bakteriális sejteket összegyűjtöttük, és lizáltuk a forralásos módszer szerint [Holmes, D.S. és. Quigley, M.: Anal. Biochem. 114, 193 (1981)]. A plazmid DNS-t tovább tisztítottuk vagy cézium-klorid gradiens centrifugálással, vagy oszlopkromatogrófiával Sepharose 4B oszlopon (Pharmacia, Uppsala, Svédország), amint ezt Maniatis és munkatársai leírták (fentebb idézett munka, 93-96 oldal). A kitermelés rendszerint mintegy 400 pg DNS/liter tenyészet. f. ) Vektor. dG-farokkal ellátott pBR322 plazmid DNS-t (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) alkalmaztunk- a t-PA-hoz és u-PA-hoz szolgáló cDNS klónozásához. A pBR322 részletes molekulaszerkezetét Maniatis és munkatársai írják le (fentebb idézett munka, 5. és 488. oldal). A rekombináns pBR322-vel végzett transzformáláshoz E. coli HB101 vagy MM294 törzset használtunk (Maniatis és munkatársai, fentebb idézett munka, 504.oldal). A t-PA és u-PA génekből származó DNS fragmensek szubklónozását pUC plazmidokban hajtottuk végre - ezek pBR322 eredetű vektorok, amelyek lac Z, valamint ampicillináz géneket tartalmaznak [Viera, J. és MesBing, J.: Gene, 19, 259 (1982)]. Ezen kivül a plaz-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
