200795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás többszörös horgokat tartalmazó plazminogén aktivátorok előállítására
1 HU 200795 B 2 A találmány. tárgya eljárás több heterológ polipeptid horgot tartalmazó hibrid plazminogén aktivátor előállítására. A plazminogén aktivátorok a szerint proteázok egy osztályát képezik, ezek alakítják a plazminogént plazminná. A plazmin el-' roncsolja a vérrögök fibrin-mátrixát, ezáltal helyreállítja egy nyitott érrendszer hemodinamikus körülményeit, miután egy belső érsérülés trombózist vagy tromboembóliát idézett elő. Az érbetegségek - beleértve a véredények részleges és teljes elzáródását -, amelyek plazminogén aktivátorokkal végzett kezeléssel irányíthatók, például a hűdést, tüdóembóliát, miokardiális infarktust, valamint a mélyvénás és perifériás artériás elzáródásokat. A humán plazmában és más testfolyadékokban található plazminogén aktivátoroknak két immunológiailag elkülönült típusa van - az urokináz típusú plazminogén aktivátor (u- PA; Mr, 55000) és a szövet-típusú plazminogén-aktivátor (t-PA; Mr; 68000). A szövet-típusú plazminogén-aktivátor aktivitását a fibrin potencírozza. Az enzim egy vérrög helyénél működik, és nagyobb affinitást mutat a fibrinhez, mint az urokináz típusú plazminogén aktivátor [Haylaeris és munkatársai: J. Bioi. Chem., 257, 2912 (1982)]. Ezért a szövet-típusú plazminogén-aktivátort tekinthetjük a fiziológiailag megfelelő trombolitikus szernek. Mindkét aktivátorra, az u-PA-ra és a t-PA-ra jellemző, hogy 1.) egyedi láncú proenzimként szintetizálódnak, amelyeket plazminnal vagy tripszinnel el lehet hasitani anélkül, hogy diszulfid-híddal öszekötőtt kétláncú molekulaszerkezetük elroncsolódna; redukció hatására mindegyik plazminogén-aktivátor elhasad egy nehéz és egy könnyű láncra (Mr 33 000 az u-PA-nál; Mr 35 000 t-PA-nál); 2.) mindkét enzim szerin-proteáz, amelyeket szerinre fajlagos reagensekkel, pl. diizopropil-fluorofoszfáttal inaktiválni lehet; 3.) mindkét enzim tartalmaz aminosavaknak egy olyan hármas diszulfid-híddal összekötött szekvenciáját, amely hurkot vagy horgot képez a molekulában. Az urokináz plazminogén altivátornak egy egyedi horga van. A szöveti plazminogén-aktivátornak két horga van, amelyeket egy hexapeptid kapcsoló-szekvencia kőt össze. Ezeket a horgokat vélik felelősnek az enzimek kötéséért a fibrinhez [Thorsen: Biochem. Biophys. Acta., 393, 55 (1975)). A t-PA DNS szekvencia elemzését és aminosav-szekvenciáját Pennica és munkatársai [Nature, 301, 214 (1983)], Ny és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 5355 (1984)), valamint a Genentech Inc. (93,619 számú Európa szabadalmi bejelentés) közölték. Az u-PA DNS szekvencia elemzését és aminosav-szekvenciáját a Genetech Inc. közölte a 92,182 számú Európa szabadalmi bejelentésben, az urokináz cDNS-t pedig Verde és munkatársai tárgyalták [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 4727 (1984)]. A találmány tárgya eljárás hibrid, harmadik generációs plazminogén aktivátorok előállítására, amelyek többszörös, heterológ polipeptid horgokat tartalmaznak. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek 2-6 horgot tartalmazhatnak. A heterológ horgokon olyan polipeptid terméket értünk, amely legalább egy olyan horgot tartalmaz, amely egy eltérő, természetben előforduló forrásban található, vagy egy olyan további horogszerkezetet, amely azonos ezzel, és egy natív plazminogén aktivátorban található horgokon felül található. Nyilvánvaló, hogy amikor az a cél, hogy egy közős horog-szerkezetet adjunk egy natív plazminogénaktivátorhoz a találmány szerinti hibrid plazminogén aktivátorok előállítására, a DNS-t kémiailag szintetizáljuk és a közős horoghoz tartozó DNS kodonnak különböznie kell attól, amely a natív plazminogén aktivátorhoz tartozó kódoló DNS szekvenciában található, hogy elkerüljük a rekombinációt (kihurkolódás), miközben a natív horog kívánt aminosav-szekvenciájat alkotjuk meg. A találmány szerinti eljárással előállított hibrid plazminogén aktivátorokban jelen levő horgok, bár külön-külön homológ területeket tartalmaznak, természetükben heterológok, és ennek eredményeképpen a találmány szerinti eljárással előállított plazminogén aktivátorok horgaik kombinációiban bármilyen natív plazminogén aktivátorban található kombinációktól, vagy aminosav-szekvenciójukban, aminosav-számukban és/vagy méretükben különböznek. A találmány tárgya továbbá eljárás a hibrid plazminogén aktivátorokat kódoló gének és kulcs-fragmenseik a teljes polipeptideket kódoló DNS-t és annak kulcsfragmenseit tartalmazó kifejező vektorok, ezekkel a kifejező vektorokkal transzformált mikroorganizmusok vagy sejttenyészetek előállítására, valamint eljárás a hibrid plazminogén aktivátorok alkalmazására. A horog egy háromszor hurkolt polipeptid-szerkezet, amelyet három diszulfid-kötés alakít ki. A horgok hosszúsága változó, mintegy 79-82 aminosavból állnak. A humán urokináz egyedi horga [Gunzler és munkatársai: Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 363, 1155 (1982)], a humán szöveti plazminogén-aktivátor két horga (Pennica és munkatársai: Nature, 301, 214 (1983)], a humán protrombin két horga [Walz és munkatársai: Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA, 74, 1969 (1977)] és a humán plazminogén öt horga [Sottrup- Jensen és munkatársai: a Progress in Chemical fibrinolysis and Thrombolysis c.' kiadványban (szerkesztők: Davidson és munkatársai), 3, 191 (1978)] között, nagymértékű szekvencia-homológia áll fenn. A horgon belüli diszulfid hidakban jelen levő hát cisztein relativ helyzete megőrződik minden horogban. A .horog', .horgok' kifejezést ebben a bejelentésben úgy értelmezzük, mint olyan szerke-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
