200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
5 HU 200794 B 6 jedó cDNS kiónokban levő szekvenciát is, az ábra tetejénél (vastag vonal) a fontosabb restrikciós enzim-helyek vannak jelölve. Minden restrikciós enzim-kód ebben az ábrában a hagyomány szerinti. Más restrikciós enzimhelyek az alsó párhuzamos vonalakban vannak jelölve, hogy egyszerűbbé tegyük az ábrát. A vázolt vonalak az ábra alján jelzik a P.195 génre vonatkozó helyzetet, amelyből a különböző plazmid-beiktatások származnak, amelyek mind cDNS beiktatások, kivéve a Gl-et, amely genomiális-beiktatást képvisel. X és Y jelzik a P.Í95 kódoló szekvencia vélt 5’ illetve 3* végeit. A 3. ábra mutatja be a P.195 gént magában foglaló genom DNS szakasznak egy restrikciós térképét. A skála Kbp-ben van és referencia-pontként a P.195 gén egy Hind III restrikciós helye szolgál, amely vastag nagy H betűvel van jelölve az ábrában. A többi restrikciós enzimek a következőképpen vannak jelölve: E(EcoRI), R(Rsal), A(AluI), M(MboI), Pv(PvuII), N(Ndel), T(Ta^I), B(BamHI) és P(Pstl). A restrikciós térkép alatt bemutatott szekvencia szakaszok azok, amelyekről úgy találtuk, hogy hibridizálódnak a jelzett fajlagos kiónokhoz. A zárójelekben levő számok azok a cDNS kiónok, amelyekhez a szegmensek hibridizálódnak; a számok mindig az idevágó pPFc kiónokra vonatkoznak. Ahol van egy szám is a zárójeleken kivül, amelyet a fentebb jelzett betűkből kettő követ, ez azt jelzi, hogy az alkalmazott vizsgáló minta kisebb, mint a teljes klón, és a szám jelzi a fragmens hosszát Kbp-ban és a betűk jelzik az említett fragmenst kialakító alkalmazott restrikciós enzimeket. A 4. ábra mutatja be a P.195 DNS fragmenseinek kifejezésére használt két plazmid megalkotását. A pWRL507-nek több jellegzetes restrikciós helye van, amint ezt az ábrában jelezzük, és jellegzetes gén-funkciói, ahol Ptrp egy promotor, trpE pedig antranilát szintetáz I, az AmpH viszi át az ampicillin rezisztenciát és Tét* viszi át a tetraciklin rezisztenciát. A pXY460-nak szintén vannak jellemző restrikciós helyei, amint ezt jelezzük, egy promotorja (Ptac), egy fs-galaktozidázt kódoló génje (lac1) és egy ampicillin rezisztenciát átadó génje, Amp*. A fentebb említett DNS szekvenciát úgy lehet jellemezni, hogy lényegében az 1. ábrában bemutatott szekvenciának egészével vagy egy részével rendelkezik, a fentebb említett körülményeknek és az ilyen szekvencia meghatározásából következő kísérleti hibák mérlegelésének van kitéve. A fentebb említett DNS szekvenciát azzal is lehet jellemezni, hogy lényegében a 2. és 3. ábrákban bemutatott restrikciós térképpel rendelkezik, amelyet az itt leirt módon határoztunk meg. A genetikai szekvenciát a kémiai hasítási módszerrel határoztuk meg (Maxam, A. és Gilbert, W.: Meth. Enzy.mol. 65, 499 /1980/) vagy a didezoxi-módszerrel (Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. 74, 5463-5467 /1977/) a cél DNS fragmenseinek szubklónozása után az M13mp8 és M13mp9 bakteriofág klónozó vektorokba (Messing, J. és Vieira, J.: Gene, 19, 269-276 /1982/). Az 1, ábrában bemutatott szekvencia elemzése megmutat egy start kodont (AUG) a 216. helynél, amelyet további 1654 kodon nyitott leolvasó kerete követ. A peptid gén termékek kalkulált molekulatömege 189, 953. A start kodont egy 18 kodonos vélt szignál szekvencia követi, amely olyan aminosav-szekvenciát kódol, amelynek le kell hasadnia, mielőtt az éretté válik. A 447-527 nukleotidok a szerin-glicin-gücin és szerin-valin-alanin tripeptid szekvenciák váltakozó ismétlődései kódolják, amely tripeptidek a P.195 83 000 mole ku látómé g ú fragmensén be-' lül fordulnak elő (6. példa). Az aminosavak némelyikének eloszlása az átfordított szekvencián belül aszimmetrikus. Így pl. a 19 cisztein maradékból kettő van a vélt szignál peptidben és 11 van a C-terminális 97 aminosavban (42 000 molekulatömegű fragmens). Asn-X-Ser vagy Thr szerkezetű (ahol X lehet bármelyik közönséges aminosav prolin kivételével 11 tripeptid szekvenciát azonositottunk, amelyek lehetséges N-glikozilező helyek. Az 1. ábrában bemutatott szekvencia-adatokat használva fel lehet becsülni, hogy a- szekvencia bármelyik részének megfelelő peptidet lehet szintetizálni pl. a Merrifield által leirt módszereket alkalmazva (Merrifield, R.B. és Marglin, A.: Ann. Rev. Biochem. 39, 841 /1970/). Így a találmány egy további megtestesülésében egy szintetikus peptidet nyújtunk, amely a P.195 legalább egy epitopját tartalmazza. A .szintetikus’ kifejezés, ahogyan itt használjuk, olyan peptidekre vonatkozik, amelyeket pl. a fentebb leirt kémiai módszerrel állítottak elő. A P.195-öt kódoló DNS szekvencia valamely fragmensének azonosítását és klónozását pl. a következő módon hajthatjuk végre. Először messenger (hírvivő) RNS-t extrahálunk P. falciparum szinkron tenyészeteiből a sejteket először detergenssel kezelve, az mRNS-t etanolos kezeléssel és centrifugálással kicsapva és oligo-dT cellulózon kromatografálva tisztitva. A lényegében tiszta terméket használjuk azután a másolat-DNS (copy DNA, cDNS) szintetizálására, reverz transzkriptáz és DNS polimeráz alkalmazásával. Tisztítás után a cDNS-t egy plazmidba iktatjuk, amelyet azután egy gazdaszervezetbe vezetünk be transzformációval. Abból a célból, hogy kiderítsük, mely kiónok tartalmazzák a szóban forgó DNS beiktatásokat az Így létrejött .könyvtár’-ban, egy vizsgáló mintát izolálunk P. falciparum mRNS-t szacharóz gradiensen keresztül centrifugálva és a frakciókat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
