200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
27 HÜ 200794 B 28 Hasonló módon a pPFcl028-ból (ahol a HindlII hely a plazmid polilinker) származó Ndel-HindlII fragmenst először mint tompa végű HindlII fragmenst pUC9-be szubklónozzuk, ahol a pUC9-et előzőleg HindlI-vel és 5 HindIII-al elhasitottuk. Miután ezt a fragmenst EcoRI-el és HindIII-al hasított pWRL 507-be beiktattuk, az új képződményt EcoRI-el kinyitjuk, Bal 31-el kezeljük, majd újra kór alakúvá tesszük, amint ezt fentebb leir- 10 tűk. Egy törzs egy mintegy 56 000 molekulatömegű fúziós fehérjét termel, amelyet anti-P.195 szérummal végzett Western-foltképzéssel mutatunk ki, és a P.195 génhez szolgáló kódoló terület C-terminálisának 190 amino- 15 sav-szekvenciáját tartalmazza. Az egyes fúziós fehérjék viszonylag tiszta készítményeit állítjuk elő sejt-lizátumokból. A törzsből egy egyedi telepet növesztünk egy éjszakán át 37 °C hómérsékle- 20 ten 100 pl M9 tápközegben, amely 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz. A következő napon az egy éjszakán át nőtt tenyészetet 400 ml M9 tenyészettel higitjuk, amely 50 pg/ml ampicillint és 10 pg/ml indol-akrilsavat is tar- 25 talmaz és 5 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A baktériumokat centrifugálással nyerjük ki 6000 g-nél 10 percen át. A bakteriális szemcséket 10 ml 25 mmól/literes Trisben (pH 8,0) szuszpendáljuk, amely 30 1 mmól/liter EDTA-t, 1 mmól/liter PMSF-et, 0,2% (térf./térf.) NP40-et és 1 mg/ml lizozimot is tartalmaz, majd jégen hagyjuk 2 órán át. Ez idő után 20 pl 1 mól/literes MgSCto oldatot és 200 pl 1 mg/ml-es DNA-z oldatot 35 adunk hozzá, és a mintát inkubálódni hagyjuk további 2 órán át jégen. Az oldhatatlan anyagot centrifugálissal kinyerjük 20 000 g-nél 10 percen át, és a felülúszót (SÍ) megőrizzük. A szemcsés anyagot 10 pl szuszpen- 40 zióval mossuk, amely szuszpenzió 5 mmól/liter ECTA-t, 5 mmól/liter EDTA-t, 1 mmól/liter PMSF-et és IX NP40-et tartalmazó 50 mmól/literes Tris-HCl-ből (pH 8,0) áll. Az anyagot 20 000 g-nél centrifugáljuk 10 45 percen át,*és a felülúszót megőrizzük (S2). A szemcséket újra szuszpendáljuk 10 ml oldatban, amely 50 mmól/liter Tris-HCl-t (pH 8,1), 5 mmól/liter EGTA-t, 5 mmól/liter EDTA-t, 0,5 mól/liter KSCN-t tartalmaz, majd 50 20 000 g-nél centrifugáljuk 10 percen át, egy harmadik felülúszót (S3) és egy szemcse- frakciót (P) nyerve. A szemcsefrakciót 10 ml HíO-ban újra szuszpendáljuk 0,1% <tö- i meg/térfogat) nátrium-dodecil-szulfát hozzá- :55 adásával illetve a nélkül, hogy az anyagot szolubilizáljuk, majd élénken dializáljuk ■ 0,89%-os NaCl-el szemben. Az egyes felülúszó- és szemcsefrakciók alikvotjait SDS-PAGE-val és coomassie-kékfestéssel és Wes- 60 tern-foltképzéssel analizáljuk. Azokban az esetekben, ahol a fúziós fehérje kifejeződése magas szintű, ez az eljárás olyan végső szemcsefrakciót eredményez, amely zömmel a fúziós fehérjét tartalmazza, és ezért a fúziós!^ 16 fehérje hatásos tisztítását hozza létre. Azokban az esetekben, ahol a kifejeződés szintje alacsonyabb, a fúziós fehérje mind az SÍ, mind a P frakciókban jelen van. A pPFcl028-ból származó két Ddel fragmenst, amelyek a 2961.-4754. nukleotidoknak (1793 nukleotid) és 4753.-5128. nukleotidoknak (375 nukleotid) felelnek meg, tisztítunk agaróz gélelektroforézissel, kezelünk 0,04 egység Bal 31 nukleázzal 30 °C hőmérsékleten 2,5 percen át, majd helyreállítjuk a DNS polimeráz I Klenow-fragmensével, amint ezt korábban leírtuk. A DNS-t előzőleg Smal-el elhasitott pXY460-ba ligáljuk éa borjú alkalikus foszfatázzal kezeljük; ezt alkalmazzuk azután JM105 (Yanisch-Perron és mtársai., J.Gene, 33, 103-119) sejtek transzformálására ampicillin rezisztenciára. Transzformánsokat helyezünk Xgal-t tartalmazó agarlemezekre és az Így létrejött kék telepeket kiemeljük. Az ilyen módon nyert törzseket átvizsgáljuk a plazmid DNS restrikciós enzimes analízisével, coomassie kékfestéssel és a lizátumok Western foltképzésével IPTG jelenlétében nőtt sejtekből. A nagy Dde fragmenst tartalmazó törzsek mind termelnek egy nagy fúziós fehérjét, amely reagál a nyúl-polivalens anti-P.195 szérummal. 10 törzset, amelyek a kisebb Ddel fragmenst tartalmazzák, vizsgálunk át a fentebb leírt módon, de csak egyről tűnik úgy, hogy egy fúziós fehérjét termel, amely lényegesen nagyobb, mint a vad típusú fi-galaktozidáz, és ez a fúziós fehérje reagál a nyúl anti-P.195 szérummal. Bár a további törzsek tartalmazzák a beiktatott részt, a gén-termék azonos méretű, mint a normális /5-galaktozidáz és nem reagál a nyúl anti-P.195 szérummal. Az egyetlen törzs, amely fúziós fehérjét termel, 310 bp-s beiktatott részt tartalmaz, amely megfelel a fehérje C-terminális területének. 9. példa A P.195 szekvenciák közvetlen kifejeződése E.coli-ban A pPFcl028-ból származó EcoRI-NdI és EcoRI-HindlII fragmenseket beiktatjuk pWRL 507-be, amint ezt a 8. példában leírtuk, ,és közvetlenül kifejezzük, a trpE kifejeződő plazmidban a Pstl-EcoRI fragmens helyettesítésével a pXY460-ból származó Pstl-EcoRI fragmenssel (4. ábra). Ebben a konstrukcióban a trp szabályozó területet és kódoló szekvenciát a tac szabályozó terület (de Boer, H.A. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. 80, 21-25 /1983/) és egy AUG start kodon helyettesíti. Közvetlenül kifejezett termékeket mutatunk ki sejt-lizátumokban Western-foltképzéssel tisztított P.195 ellen készített antiszérummal. Az ebből a két konstrukcióból származó közvetlen kifejeződési termékek látszólagos molekulatömege 47 000, illetve 70 000.
