200794. lajstromszámú szabadalom • Eljárás malária antigének kifejezésére
23 HU 200794 B 24 idézett munka). 910 ml tenyészet-felülúszóból kiindulva 5,9 g fehérje van jelen az affinitás-oszlopból nyert eluátumban, 2,6 mg fehérje halad ót a Protein A-Sepharose oszlopon, és 400 jug tisztított fehérjét vetünk alá Edman-lebontásnak. A következő részleges aminosav-szekvenciát nyerjük a lebontás egymást követő ciklusaiból a polipeptid N-terminális aminosavánál kiindulva 1 2 3 4 5 6 7 N.I N.I N.I N.I N.I Tyr Gin 8 9 10 11 12 13 14 Glu Leu Val Lys Lys Leu Glu Phe Phe 15 16 17 18 19 20 Alá Leu Glu Asp Ala Val Az 1-5 helyzeteknél levó helyzeteknél a maradékokat nem azonosítottuk tisztán (N.I) és a lizin és fenil-alanin-származékokat nem különítettük el egymástól az alkalmazott HPLC rendszerben. A cDNS-ből és genom DNS klónokból származó nukleotid szekvenciák vizsgálatával látható, hogy a maradékoknak (6-20) ez a szekvenciája megfelel az átfordított szekvencia 288-332 nukleotidjainak. Az elemzés alapján a 83 000 molekulatömegű fragmens a P. 195 prekurzor amino-terminális szekvenciájából származik. A teljes szekvenciában az AUG (metionin) start kodont a 216-nuKleotidnál 18 aminosav nukleotid szekvenciája követi, amely megfelelhet egy olyan szignál szekvenciának, amely több membrán- vagy kiválasztott fehérjéhez szolgáló elsődleges transzlációs terméken lehet jelen, és amelyet normálisan le lehet hasítani s fehérje áthatolása során az endoplazmás retikulum belső terébe (Kreil, G.: Ann. Rev. Biochem, 50, 317-348 /1981/Ï. 7. példa Antitestek reakciója P.195 feldolgozott tragmenseivel és ezeknek a fragmenseknek az elhelyezkedése a lineáris kódoló szekvencián belül Közvetlenül aminosav-szekvencia elemzéssel a 83 000 molekula tömegű fragmens amino-terminálisa a P.195 amino-terminálisához közel helyezkedik el (6. példa). Az in vivo proteolitikus feldolgozódás által termelt egyéb fragmensek genetikai kódja lineáris génszekvenciában helyezkedik el a P.195 ellen előállított fajlagos antitestek (előnyösen monoklonális antitestek) által felismert polipeptidek méretanalizise alapján. Két monoklonális antitestet használunk ebben az elemzésben. A 89.1 antitest (Holder és Freeman, 1982, fentebb idézett munka) az intracelluláris P.195-el reagál a schizontában és a 83 000 molekulatömegű fragmenssel a merozoita felületén. Ez nem reagál (immunfluor- 14 eszcenciával) a parazita ezt követő gyűrű stádiumával, egybehangzóan azzal, hogy ez a fragmens a merozoita vörösvértestekbe behatolása (inváziója) során elvész. A 111,2 antitest az intracelluláris P.195-el reagál a schizontában, a merozoita felülettel és a gyürű-stádiumban levő parazitával immunfluoreszcenciával. Ez a fajlagosság hasonló egy olyan monoklonális antitest fajlagosságához, amelyet korábban Hall és munkatársai írtak le (1984 a, fentebb idézett munka). A P.195-öt és feldolgozott fragmenseit in vitro lehet jelezni P5SJ metioninnak a parazita tenyészeteihez adásával metioninmentes tápközegben (Holder és Freeman, 1982, fentebb idézett munka; Freeman és Holder, 1983, fentebb idézett munka). A feldolgozott fragmenseket s természetesen kibocsátott merozoiták felületén lehet jelezni radio-jódozással (125Il jóddal, laktoperoxidázt alkalmazva, amint ezt korábban leírták (Freeman és Holder, 1983 b, fentebb idézett munka, Holder és Freeman, 1984 b, fentebb idézett munka). A l“S] metionin-jelzett schizonta detergens extraktumaiból egy P.195 elleni nyúl polivalens antiszérum immunológiailag kicsapja a P.195-öt és fragmenseit, amelyek molekulatömegei 153 000; 110 000; 83 000; 45 000; 42 000 és 29 000, amint ezt SDS-PAGE elemzéssel meghatároztuk. Nem redukáló géleken (ditiotreitol távollétében) a 45 000 és 42 000 molekulatömegű fragmensek a 38 000 illetve 36 000 látszólagos molekulatömeggel vándorolnak. A 89.1 antitest immunológiailag kicsapja a P.195-öt és a 153 000; 110 000 és 83 000 molekulatömegű fragmenseket. A 111.2 antitest immunológiailag kicsapja a P.195-öt és a 45 000 és 42 000 molekulatómegű fragmenseket. A felületen jelzett merozoiták detergens-extrak turnéból a polivalens anti- P.195 szérum három fragmenst csap ki immunológiailag, amelyek látszólagos molekulatömege 83 000 illetve 42 000 illetve 19 000. A 83 000 molekulatömegű fragmenst immunológiailag kicsapja a 89.1 antitest A 111.2 antitest immunológiailag kicsapja 42 000 és 19 000 molekulatömegű fragmenseket. Ezeknek a fragmenseknek az elemzése peptid-térképezéssel azt mutatja, hogy ezek valószínűleg a P.195 nem átfedő darabjai (Holder és Freeman, 1984 b, fentebb idézett munka). Ezekre az adatokra, valamint a 6. és 10. példában leirt adatokra alapozva a P.195 kódoló szekvencián belül a fragmensek lineáris sorát meg lehet határozni. A 83 000 molekulatómegű fragmens amino-terminálisához meghatározott aminosavszekvencia, megfelel a gén kódoló területének 5’ végénél levő szekvenciának, közvetlenül a feltételezett szignál szekvencia után. Ennél fogva a 83 000 molekulatömegű fragmens a P.195 amino-terminálisának 42%-ából származik. A 153 000 molekulatömegű fő átmeneti feldolgozódó fragmens, amelyet a 89.1 antitest felis-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
