200793. lajstromszámú szabadalom • Génsebészeti eljárás új, humán interleukin-2-fehérje előállítására
17 HU 200793 B . 18 3. TÁBLÁZAT Aminosav Mól % Asp/Ash 8,8 Thr 9,3 Ser 5,7' Glu/Gln 13,7 Lépés Kimutatott PTH-aminosav 16 Y* 17 Leu 18 Leu 19 Leu 20 Asp Pro 3,4 Gly .1,7 Ala 3,8 1/2 Cys 2,3 Val 3,1 Met 3,7 lie 6,3 Leu 16,3 Tyr 2,3' Phe 4,5 Lys 8,3 His 2,5 Arg 3,1 Trp 1,1 (4) N-terminélis aminosav-szekvencia • Az említett humán IL-2 fehérje 34 Mg-°s adagját elemezzük az N-terminélis aminosav-szekvenciára, erre a célra az automatikus Edman-lebontási módszert alkalmazva, egy gázfázisú fehérje szekvencia-me gállapító (sequenator) (470 A modell, Applied Biosystems, Amerikai Egyesült Államok) segítségével. Fenil-tiohidantoin-aminosavakat (PTH-aminosa•vak) azonosítunk nagy teljesítményű folyadék-kromatogréfiával Micropak-SP oszlopot (Varion, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazva. Az egyes lépésekben kimutatott aminosavat vagy aminosavakat a 4. táblázat mutatja be. 4. TÁBLÁZAT 10 * még nincs azonosítva (5) C-terminális aminos&v Az említett IL-2 fehérje 33 ng-os adagját üveg kémcsőbe helyezzük hidrazirios le- 15 bontáshoz, 0,05 ml vízmentes hidrazint adunk hozzá és a csövet vákuumban leforrasztjuk, majd 100 °C hőmérsékleten 6 órán át melegítjük. Az igy nyert hidrazinos bontási terméket liofilezzük és desztillált vízben oldjuk. 20 Benzaldehidet adunk az oldathoz, a keveréket szobahőmérsékleten 1 órán ét kevertetjük, majd centrifugáljuk. Az igy nyert vizes réteget liofilezzük és aminosav-analizisnek vetjük alá, Hitachi 835 aminosav-analizátort 25 alkalmazva. Kizárólag treonint mutatunk ki.' (6) Tripszines peptid-térképezés Az emlitett IL-2 minta 15 Mg~os adagját 0,4 /mg tripszinnel (Washington, Amerikai Egyesült Államok) emésztjük 120 Ml 0,02 mól/ 30 /literes nátrium-hidrogén-karbonátban 37 °C hőmérsékleten 18, órán ét. Ezután 5 m1 2-merkapto-etanolt adunk hozzá és a reakciót további 2 órán ét folytatjuk 37 °C hőmérsékleten. Ezután a reakciót befejezzük 75 m1 1%- 35 -os trifluor-ecetsav hozzáadásával. A reakcikeverék nagy teljesítményű folyadékkromatográfiéja, amelyet az alább megadott körülmények közőst végzünk, a 6. ábrában bemutatott térképet adja. Oszlop: Ultrasphere-Octyl (5 um; 4,6 k x‘250 mm; Altex, Amerikai Egyesült Államok) ' Oszlop-hőmérséklet: 30 °C Mozgó fázis: A oldószer: , 0,02% trifluor-ecetsav - 99,98% víz; B oldósifer: 0,02% trifluor-recetsav - 99,98% acetonitril;' 0. perc (95% A oldószer + 5% B, oldószer) - 40. perc (30% A oldószer + 70% B oldószer); Áramlási sebesség: 1 ml/perc; Kimutatás: Fluoreszcenciás módszer [Analytical Biochem., 67, 438 (1975)], fluoreszcamint (Roche, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazva (7) Aktivitás az IL-2-függő sejtvonalakkal szemben A találmány szerinti nein-glikozilezett humán IL-2 fehérje meghatározása a Biochem. Biophys. Rés. Commun., 109, 363 (1982) szerinti módszerrel összhangban azt mutatja, hogy az 'említett IL-2 fehérje rendelkezik olyan aktivitással, hogy elősegítse a triciummal jelzett timidin beépülését egy IL-2-függő Lépés Kimutatott PTH-arainosav 45 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Alá Met Pro Alá Thr Pro Ser Thr Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Gin 50 55 60 65 11
