200792. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új fibrinolitikus enzimek és hatóanyagként a fenti enzimeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
17 HU 200792 B 18 g) Fibrin-kötódési vizsgálatok A GPK-ból és BEB-böl származó enzimek fibrinalvadékhoz való kötődését úgy határozzuk meg, hogy 1 ml 1,5 mg/ml-es plazminogén-mentes fibrinogént, 25 pl 25 jug/ml koncentrációjú GPK-t vagy BEB-t 50 /ul 20 NIH egység/ml koncentrációjú trombint összekeverünk. A fenti elegyet 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 mól/l-es nótrium-dietil-barbiturát-pufferban (pH 7,8) 37 °C-on 30 percen át inkubáljuk. Az alvadékot centrifugálással elválasztjuk, pufferrel mossuk, és 1 ml 1 mól/1 kálium-rodanidot tartalmazó 0,05 mól/l-es nátrium-dietil-barbiturát pufferrel (pH 7,8) extraháljuk. Az alvadék felülúszójából és az alvadék extraktumából vett alikvotokat plazminogént tartalmazó fibrin-lemezen vizsgáljuk. Az eredmények azt mutatják, hogy az enzim legnagyobb része kötődik a fibrin-alvadékhoz, és kevés vagy éppen semmi aktiv enzim nem marad a felülúszóban. Az urokinázzal végzett kísérletekben viszont nem találtunk jelentős kötődést fibrinalvadékhoz. h) A GPK-ból származó enzim kötődése kísérleti trombushoz mesterséges keringési rendszerben A GPK-ból származó enzim teljes véralvadékhoz való kötődésének képességét in viti-o Chandler-féle hurkos keringési rendszerben vizsgáljuk. A kísérleti keresztkötött trombust 0,01%-os Tweennel előzőleg mosott 3 mm belső átmérőjű polietilén csőben állítjuk elő úgy, hogy 1 ml citrátos emberi vért 50 pl 0,05 mól/l-es kalcium-kloriddal és 25 yul 100 NIH egység/ml trombinnal keverünk. Az elegyet 37 °C-on 1 órán ót inkubáljuk 30 fordulat/perc sebességű forgóasztalon, majd a trombust Petri-csészébe öntjük és 0,25 súly% zselatint és 0,1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 mól/l-es nátrium-dietil-barbiturát pufferrel (pH 7,8) kétszer mossuk. A trombust ezután 0,9 ml autológ plazmával vagy pufferrel visszaszivjuk. Hozzáadunk 100 pl (közel 500 NE) GPK-ból származó enzimet, a hurkot visszahelyezzük a forgóasztalra és további két órán ót inkubáljuk 37 °C-on. Az alvadékot eltávolítjuk, a fenti módon pufferral mossuk, majd 1 ml 1 mól/1 kálium-rodanidot tartalmazó 0,05 mól/l-es dietil-barbiturát-pufferrel (pH 7,8) extraháljuk. Az alvadék extraktumából és a csőben lévő alvadék felülúszójóból 50 pl-es alikvotokat plazminogéntartalmú fibrin-lemezre viszünk és 18 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A kapott eredmények azt mutatják, hogy az alvadék extraktumónak aktivitása, vagyis a kötött enzim fibrinolitikus aktivitása jelentősen meghaladja az alvadék felülúszójónak fibrinolitikus aktivitását. A kísérleteket ulIndiummal jelzett enzimmel megismételve hasonló eredményeket kapunk. A fenti eredmények alapján a radioaktiv jelzésű enzimek in vivo diagnosztikai célra is használhatók a trombus lokalizálására. i) Immun-diffúzió analízis Rijken és Collen [J. Bioi. Chem. 256 (13), 7035 (1981)] módszerével nyúlban GPK-ból és BEB-ból származó enzim elleni antiszérumot termelünk. Az antiszérum IgG frakcióit Protein-A-Sepharose oszlopon izoláljuk. A kettős immun-diffúziós analízist 1,5%-os agar-gélben hajtjuk végre Ouchterlony és Nilsson (Handbook of Experimental Immunology, 2. kiadás, 19. fejezet, Blackwell, Oxford) módszere szerint. A kilyukasztott agar mélyedésébe bemérjük a mintát és egy éjszakán át 4 °C-on nedves atmoszférában diffundóltatjuk. Az eredmények alapján a GPK-ból és a BEB-ból származó enzimek immunológiai tulajdonságai hasonlóak, és a nyúl anti-GPK és anti-BEB nem reagál urokinázzal. Hasonlóképpen egyik enzim sem mutat keresztreakciót az urokináz elleni ellenanyaggal. j) A GPK-ból származó enzim aktivitásának gátlása 2-merkapto-etanollal 0,01% Tween 80-at tartalmazó 0,05 mól/1- -es nátrium-dietil-barbituráttal (pH 7,8) a 2- -merkapto-etanol alapoldatból különböző hígításokat készítünk. 25 pg/ml GPK-ból származó enzimet azonos térfogatú 2-merkapto-etanol hígítással keverünk, és az elegyet 37 °C-on inkubáljuk. A kontroliban az enzimet azonos térfogatú pufferoldattal inkubáljuk. 15 perc elteltével a mintákból 50 pl-es alikvotokat plazminogéntartalmú fibrin-lemezen vizsgálva megállapítjuk a maradék enzimaktivitást. Az enzim aktivitásét fibrinalvadék 11- zisidő módszerrel is megvizsgáljuk. A kapott eredmények azt jelzik, hogy 10 mmól/1, vagy annál nagyobb koncentrációjú 2-merkapto-etanollal végzett inkubálás hatására az enzim aktivitása jelentősen, 80%-nál nagyobb mértékben gátlódik. Ezek az eredmények, a molekulatömeg-meghatározás során kapott eredményekkel összhangban azt mutatják, hogy az enzimaktivitás szempontjából létfontosságú a diszulfid-hidak jelentése. k) Poli-D-lizin hatása a GPK-ból származó enzim aktivitására A poli-D-lizin hatását részlegesen tisztított GPK-ból származó enzim plazminogénaktivátor hatására lényegében Allen [Thromb. Haemostas. (Stuttgart) 47, 41 (1982)] módszere szerint vizsgáljuk. A reakcióelegy 400 ul, 25 pl (0,4%) Tween 80-at . tartalmazó 0,05 mól/l-es Tris-HCl-pufferből (pH 7,5), 125 pl 2001 pg/ml koncentrációjú plazminogénböl, 200 pl 3,5 mmól/1 koncentrációjú S-2251 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
