200752. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására biotechnológiai úton
1 HU 200752 B 2 A találmány tárgya eljárás 6-hidroxi-nikotinsav előállítására, biotechnikai úton. A 6-hidroxi-nikotinsav szerves szintézis útján történő előállítására több eljárás ismert, például 2-piridonból kiindulva a hidroxiaromások Kolbe-Schmidt-féle karboxilezésével. Más eljárások almasavból vagy piridin-2,5-dikarbonsavból indulnak ki. [Lásd: Brincourt et at.: J. Chim. Ther. (1973), 8 (2) 226-232, valamint a 7731/80 számú svájci szabadalmi bejelentést]. Az ismert eljárások azonban nem teszik lehetővé tiszta 6-hidroxi-nikotinsav egyszerű, olcsó és környezetkímélő előállítását. Az eljárások hátránya, hogy a reakció nem kvantitatív, és nemkívánatos melléktermékek kísérik. A melléktermékek szennyeződésként jelennek meg, és ezért a reakció befejeződése után el kell azokat távolítani. Ismert továbbá, hogy a Bacillus, Pseudomonas, Clostridium és Mycobakterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok nikotinsavon fejlődnek, és ezt az anyagot szén-, nitrogén- és energiaforrásként alkalmazzák [Allinson M.J.C.: J. Bioi. Chem. (1943), 147, 785; Behrmann EJ.; Stanier R.V.: J. Bioi. Chem. (1957), 228, 923], A nikotinsavat valamennyi vizsgált organizmus már az első lépésben 6-hidroxi-nikotinsavvá oxidálja. A 6-hidroxi-nikotinsavat rögtön és jelentős felhalmozás nélkül tovább alakítja. Ez a lebontás aerob mikroorganizmusoknál egészen víz, széndioxid és ammónia eléréséig lejátszódik. Csak a mikroorganizmusok feltárása után vált lehetővé, hogy a nikotinsav-hidroxilázt többé vagy kevésbé tiszta formában izolálják. [Hunt A.L.: Biochem. J. (1958), 72, 1-7] A nikotinsav-hidroxiláz mintegy 400 000 Dalton értékű nagy molekula. Ez a molekula flavinkofaktorokat, számos fématomot (Fe, Mo), szervetlen kénatomot és néhány esetben szelént is tartalmaz. A nikotinsav-hidroxiláz csak megfelelő elektronátadó rendszerek (például Cytochrome, Flavinok, NADP+ és más hasonló rendszerek) jelenlétében aktív. A nikotinsav-hidroxiláz sejtextraktumokból izolálható és az enzimpreparátum a nikotinsav hidroxilezéséhez felhasználható. Ezt az elvet követve sikerült kismennyiségű 6-hidroxi-nikotinsavat előállítani [Behrmann és Stanier: J. Bioi. Chem. (1957), 228, 923]. Eltekintve az enzimelválasztás magas költségeitől, és a nikotinsav-hidroxiláz bomlékonyságától, jelen esetben gondoskodni kell a kofaktorok és az elektronátadó rendszerek regenerálásáról is. Számos fermentációs és enzimreakciós eljárásnál a termék koncentrációja a reakcióelegyben nagyon alacsony és ezért elválasztásához nagy térfogatú reakcióelegyet kell feldolgozni. Ez magas feldolgozási, berendezési és szennyvíztisztítási költségekkel jár. Hasonló a helyzet a 6-hidroxi-nikotinsav biotechnológiai előállításánál is (825/84 számú svájci szabadalmi bejelentés). Elvileg lehetséges olyan nikotinsav-oldat enzimatikus hidroxilezése, amelyben a nikotinsav koncentrációja 0,1 tömeg% és telítettség között változik. A sejtekben található enzim stabilitása azonban magasabb szubsztrátkoncentrációnál igen alacsony. Ez jelentősen fokozza a felhasznált enzim mennyiségét és költségeit. Ezzel szemben a mikroorganizmusok (Achromobacter) növekedése már viszonylag alacsony nikotinsav-koncentrációknál is erősen gátolt. Az enzimveszteségek a sejt lassú növekedésével kompenzálhatok. Ez azonban csak hígított nikotinsavoldatban (0,1-1,5 tömeg%) történhet meg. Ebből az következik, hogy a nikotinsav enzimatikus hidroxilezését hígított oldatban kell végezni, ami növeli a feldolgozás költségeit. A találmány feladata, hogy a fenti hátrányok kiküszöbölésével olyan eljárást dolgozzunk ki, amely lehetővé teszi nagytísztaságú 6-hidroxi-nikotinsav gazdaságos előállítását nikotinsavból. A 6-hidroxi-nikotinsav biotechnológiai úton történő előállítása során a találmány értelmében úgy járunk el, hogy a nikotinsavat ekvivalens mennyiségű magnézium vagy bárium ion jelenlétében nikotinsav-hidroxilező mikroorganizmussal enzimatikusan hidroxilezzük, és a reakció közben képződő és a reakcióelegyből kiváló 6-hidroxi-nikotinsav-magnézium- vagy -báriumsót elválasztjuk és az elválasztott sóból a 6-hidroxi-nikotinsavat felszabadítjuk. A bioreaktort célszerűen olyan magnézium- vagy bárium-nikotinát oldattal töltjük fel, amelyben a só koncentrációja 0,1 tömeg% és telítettség között változik, majd hozzáadjuk a nikotinsav-hidroxilázt tartalmazó sejteket. A reakció közben keletkező magnézium- vagy bárium-hidroxi-nikotinát a telítettség elérése után kikristályosodik. A találmány szerinti eljárás során a reakcióhőmérséklet 10-50 °C között, előnyösen 25-35 °C között változtatható, a pH értéket nikotinsav adagolásával 5-9 közötti állandó értéken tartjuk. A találmány szerinti eljárás előnyösen folyamatos üzemmódban valósítható meg, amelynek során a 6- -hidroxi-nikotinsav enzimatikus hidroxilezésének megfelelő módon 0,2-10 tömeg%-os magnéziumvagy bárium-nikotinát oldatot vezetünk be az Achromobacter xylosoxydans pH=5-9 értéken tartott szuszpenziójába, és a 6-hidroxi-nikotinsav keletkező magnézium- vagy báriumsóját folyamatosan eltávolítjuk. A magnézium- vagy bárium-hidroxi-nikotinát rossz oldékonysága lehetővé teszi, hogy a termék a reakció közben magnézium- vagy báriumsó formájában szelektíven kiváljon, míg a nikotinsav oldatban marad. A magnézium- vagy bárium-hidroxi-nokotinát finom mikrokristályokat képez, amely szűréssel vagy centrifugálással könnyen elválasztható. A sóból savanyítással megkapható a tiszta 6-hidroxi-nikotinsav. A magnézium- vagy bárium-nikotinát kiindulási anyagok oldat formájában történő adagolását a vezetőképesség mérésének alapján vezetőképesség-szabályozóval összekapcsolt szivattyúval automatikusan végezhetjük. A magnézium- vagy bárium-hidroxi- nikotinét kristályok, amelyek a reakcióedény vagy egy beépített elválasztó alján gyűlnek össze, szakaszosan vagy folyamatosan eltávolíthatók. A bioreaktorba szilárd anyag adagoló szerkezettel természetesen szilárd nikotinsav is adagolható, megfelelő mennyiségű magnézium-oxiddal együtt, vagy azzal párhuzamosan. Ily módon gyakorlatilag zárt rendszert kapunk, amelybe a szilárd kiindulási anyagokat bevezetjük, és szilárd végterméket kapunk. Ebben a rendszerben 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
