200704. lajstromszámú szabadalom • Összefüggő pórusokkal rendelkező membrán-szerkezetek
HU 200704 B szénhidrogéneknek ellenállnak. Az ultraszűrd membránok szükséges pórusméretét lényegében véve úgy alakítjuk ki, hogy megfelelő mikroorganizmust választunk, amelynek sejtburka körülbelül a kialakítandó pórusméretnek megfelelő pórusokkal rendelkező S-réteget tartalmazza. A kívánt pórusméret változtatható úgy, hogy idegen molekulákat adagolunk, amelyek a P- metubránok pórusainak területére bejutnak. Ezt a későbbiekben részletesen ismertetjük. Az egy molekularétegből kialakított P-membránok rétegvastagága mintegy 5-20 nm, a pórusok átmérője 1 és 8 nm között van. A P-membrán-szuszpenzió előállításával kapcsolatban meg kell jegyezni, hogy a kaotropikus szerek, illetve felületaktív anyagok megválasztásával befolyásolható, hogy az S-réteg fragmensek csupán leváljanak a sejtburok peptidoglikán-tartalmú átegéről, vagy maga az S-réteg is dezintegrálódjon •?s oldatba menjen. így például, ha a kezelést 23 iiól/l-es guanidin-hidroklorid-oldattal végezzük, Az S-reteg fragmensek csak leválasztódnak, míg ha > mól/l-es guanidin-hidroklorid-oldatot alkalmaink, az egyes protein molekulák vagy proteint tartalmazó molekulák közötti kötődések elroncsosásával az S-réteg dezintegrálódását is elérhetjük, hogy az S-réteget tartalmazó oldat pH-ját jelentősen megváltoztatjuk, például a pH-t 7,0 értékről 2,5 értékre csökkentjük, vagy 7,0 értékről 9,5 értékre emeljük. Az önrendeződéssel kialakított P-membránok felülete lehet sík, görbült, hengeres vagy hólyagos formájú. Az 1. és 2. példa szerint készített P-membránok felülete lényegében véve sík. A10. és 11. ábrán az 1. és 2. példa szerint előállított szerkezetek olyan változatát mutatjuk be, ahol a 20’ P-membránok hólyagos formájúak. A12. ábra a 2. példa szerint előállított szerkezet egy további olyan változatát ábnrázolja, ahol sík és hólyagos formájú 20 és 20’ P-membránokat alkalmaztunk. A hólyaghos P-membránokat főleg a 21 mikroszűrő felületére juttatjuk. A P-membránok térhálósítására néhány további példát adunk meg az alábbiakban:- Hexametilén-diizocianát a P-membránokkal előnyösen az aminocsoportjaival reagál, majd miután ezek telítődtek, a hidroxilesoportokkal, így mindkét funkciós csoporton keresztül kialakuló intermolekuláris térhálósodás következik be. A hexametilán-diizocianátot például 1%-os oldatban alkalmazzuk 5%-os tetrahidrofuránnal (trietanol-amin-hidroklorid, pH = 8,0). A reakcióidő 20 °C-on például 4 óra. N,N’-Dijód-acetil-hexametilén-diamin a P-membránok szulfhidrilcsoportjait támadja, ahogyan más bifunkcionális alkil-halogenidek, megfelelő reakciókörülmények között azonban az aminocsoportokkal is reagál. Semleges vagy enyhén alkálikus közegben azonban ez a térhálósítószer a szulfhidrilcsoportokra specifikus. Térhálósításra az N,N’-dijód-acetil-hexametilén-diamint előnyösen 0,5%-os oldat (0,1 mól/l-es nátrium-aceiát-pufferben, pH = 7,2) formájában alkalmazzuk. A reakcióidő 4 °C-on 3 óra. - l-Etil-3-[3-(dimetil-amino)-propil]-karbodii-9 mid-hidroklorid (EDC) A karbodiimidek, mint pl. az EDC savas közegben a P-membránok karboxil-, szulfhidril- és hidroxilcsoportjaival reagálnak. A szulfhidril csoportokat, ha nem akarjuk, hogy részt vegyenek a reakcióban, előzőleg védeni kell. Ha a karboxilcsoportokat EDC-vel blokkoljuk, a P-membránok pK értéke a lúgos tartományba tolódik. Desztillált vízzel készült 0,1 mól/l-es EDC-oldat (0,02 mól/1 NaOH, pH=8,0) reakcióideje szobahőmérsékleten 18 óra. Az alábbiakban példaképpen felsorolunk néhány olyan idegen molekulát, amelyek a P-membránok protein molekuláihoz vagy proteint tartalmazó molekuláihoz adagolhatók, a térhálósított P- mejmbránok pórusméretének szabályozása céljából:- A porózus hordozóra, pl. mikroszűrőre lerakódott P-membránokra polikation formájú ferritin-oldatot (5 pg polikation formájú ferritin 1 ml vízben) rétegzünk, és 20 °C-on 5 percig inkubáljuk. Elektronmikroszkóppal megállapítható, hogy ilyen körülmények között minden protein molekulához vagy proteint tartalmazó molekulához egy ferritin molekula kapcsolódik elektrosztatikus kölcsönhatással. Az 1. példában ismertetetthez hasonlóan végzett utólagos glutáraldehides térhálósítással a ferritin molekulákat azután kovalensen kapcsoljuk a P-membránokhoz.- A hordozóra lerakodott P-membránokra 1%os ozmium-tetroxid-oldatot rétegzünk, és 20 °C-on 30 percig inkubáljuk. Ezután az oldat fölöslegét kimossuk, elektronmikroszkópiásan és röntgensugár mikroanalízissel megállapítható, hogy az ozmium kémiailag kötődött a P-membránokhoz. A P- membránok térhálósítását azután az 1. példa szerinti módon végezzük.- A hordozóra lerakódott P-membránokat olyan bifunkcionális térhálósítószerrel kezeljük, amely a P-membránok pórusméretének mérettartományába eső mérető hidakat hoz létre. A különböző híd hosszúságoknak megfelelően a következő bifunkcionális térhálósítószerek jöhetnek szóba: - tartaril-di-(glicil-azid) (TDGA): 13 nm hídhossz,- tartaril-di-(e-amino-kaproil-azid) (TDCA): 2,3 nm híd-hossz, - bisz-metil-3,8-diazo-4,7-dioxo-5,5-dihidroxidekán-biszimidát (DEBE): 1,4 nm híd-hossz,- bisz-metil-4,9-diazo-5,8-dioxo-6,7-dihidroxidodekán-biszimidát (DOBÉ): 1,7 nm híd-hossz.- a TDGA-val, TDCA-val, DEBE-vel vagy DOBE-vel végcett reakció (0,01 mól/1 desztillált vízben, 1 móM trietanol-aminnal pH=8,0) 4°C-on egy óra hosszat vagy 20 °C-on 30 percig tart, majd a térhálósítást az 1. példa szerinti módon végezzük. 3. példa Ebben a példában a találmány szerinti megoldás egy olyan változatát mutatjuk be, amely szerint nagyobb, 100 jim dimenziótartományba eső felülettel rendelkező réteget hozunk létre, amely egyrétegű P-membránból áll. Ehhez az 1. példa szerinti módon Bacillus stearothermophilus 3c/NRS 1536 sejtek burkából P-membrán-szuszpenziót készítünk. Ennek a bacillusnak a sejtburkában levő S-rétegnek 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
