200704. lajstromszámú szabadalom • Összefüggő pórusokkal rendelkező membrán-szerkezetek
HÜ 200704 B ugyanolyan tömegeloszlást mutatnak, mint az eredeti S-réteg. Ezeket a membrán-fragmenseket a továbbiakban P-membránként említjük. Mivel ezek a F-membránok a kaotropikus szerek koncentrációjának emelésére ismét szétesnek, illetve a kaotropikus szerek koncentrációjának ismételt csökkentésére ismét kialakulnak, feltételezhető, hogy a P- membránok egymás melletti, egymáshoz kapcsolódó, kristályrácsban elrendeződő protein molekulák vagy proteint tartalmazó molekulák rétegéből épülnek fel, és a P-membránokat képező molekulák reverzibilis oldódása, illetve rekonstituálása a molekulák nem-kovalens kapcsolódása következtében megy végbe. Az előzőleg meghatározott tömegeloszlásból felismerhető a rácsszerkezet típusa, amely négyzetes, hexagonális vagy ferdeszögű lehet. A 2-4. ábrán bemutatunk háromféle rácstípust, amelyeken felismerhető a protein molekulákból, illetve proteint tartalmazó molekulákból felépítendő S-réteg, illetve P-membrán. A 2. ábra egy p4-szimmetriájú négyzetes rácsszerkezetet mutat, a 3. ábra egy p6-szimmetriájú hexagonális rácsszerkezetet mutat, és a 4. ábra egy p2-szimmetriájú ferdeszögű rácsszerkezetet mutat. Az S-rétegek és P-membránok elektronmikroszkóppal meghatározott tömegeloszlása alapján feltételeztük, és a 2-4. ábrákon sematikusan ábrázoltuk, hogy az S-rétegeket és P-membránokat képező molekulák között jellemző formájú és méretű összefüggő pórusok helyezkednek el. Ahogy a későbbiekben részletesen tárgyaljuk, ez a feltételezés bizonyítást nyert. A továbbiakban az első példában és az 5-7. ábrával egy olyan szerkezet kialakítását ismertetjük, amelyhez P-membránt alkalmaztunk, és amely ultraszűrőként használható. 1. példa Bacillus stearothermophilus 3c/NRS 1536 sejtekből indulunk ki, amelyeknek a sejtburkát citoprazma membrán, peptidoglikánt tartalmazó réteg és S-réteg képezi. Ahogyan az a mikrobiológiai gyakorlatban szokásos, a sejteket először ultrahang-kezeléssel felnyitjuk, a citoplazma membrán fragmenseket detergensek segítségével dezintegráljuk, és a maradék sejtmembrán fragmenseket mosással megtisztítjuk a sejtkomponensektől. Ezután az S-réteget a peptidoglikánt tartalmazó rétegtől vizes közegben elválasztjuk úgy, hogy kaotropikus szerként 5 mól/1 guanidin-hidrokloridot adagolunk, és oldatba visszük. Az oldatból ezután centrifugálással elválasztjuk a peptidoglikán fragmenseket, és a tiszta oldatot 10 mmól/1 CaCh-t tartalmazó pufferoldattal szemben dializáljuk. A dialízis során, amikor a guanidin-hidroklorid koncentrációja az oldatban gyakorlatilag nullára csökken és a CaCh koncentrációja emelkedik, P-membránok képződnek, amelyek 14 nm periodicitású négyzetes rácsszerkezetet (p4-szimmetriájú) mutatnak, és amelyeknek a felületi mérete legföljebb 15 g.m. Ezeket a P-membránokat keveréssel a vizes közegben szuszpenzióban tartjuk Az ultraszűrő kialakításához az 5. ábrán bemutatott, 2 nyomás alatt működő berendezést használ5 juk. Ez 3 fenékrésszel rendelkezik, amelyen bordázott aljú, 4 hengeres horony van kialakítva, ebbe porózus 5 szinterlemez van beágyazva, az 5 szinterlemez alatti tér 6 kivezető csatornán keresztül 7 kivezetőcsővel van összekötve. A 3 fenékrészen 8 0-záró gyűrű közbeiktatásával plexiüvegből készült 9 hengeres fal van elhelyezve, amelyen egy második, 10 0-záró gyűrű közbeiktatásával 11 fedőrész van elhelyezve. A11 fedőrészben 13,14 csatlakozókkal ellátott 12 bevezetőcsatorna van kialakítva. A13 és 14 csatlakozók bevezetőcső, illetve nyomógáz-forrás csatlakoztatására szolgálnak. A11 fedőrész alsó részéhez 15 mágneses keverőegység van csatlakoztatva, amelynek 16 keverője leér a 9 hengeres fal alsó széléig. A nyomás alatt működő berendezés fenék- és fedőrészét működtetéskor egy, 17 és 17 helyre kapcsolt összekapcsoló eszköz tartja össze. Az ultraszűrő előállításához a nyomás alatt működő berendezésben levő 5 szinterlemezre egy tárcsa formájú 18 mikroszűrőt helyezünk el (Nuclepore, Tübingen, NSZK gyártmány), amely az előállítandó ultraszűrő hordozójaként fog szolgálni. Ez a 18 mikroszűrő 10 gm vastag, egyenletes pórusmérető, 0,1 jxm pórusátmérőjű polikarbonát-filmből áll. A fent ismertetett módon elkészített P-membrán-szuszpenziót a 13 csatlakozón keresztül a 11 fedőrészbe öntjük olyan mennyiségben, hogy a mikroszűrőre cm-énként 25 p.g P-membrán jusson. Ezután a 14 csatlakozón keresztül 0,5.10s Pa túlnyomással nitrogéngázt vezetünk be, aminek hatására a szuszpenzió folyadékfázisa a 18 mikroszűrőn és 5 szinterlemezen keresztül eltávozik, és a P- membránok a 18 mikroszűrőre lerakódnak. Ezután a 13 csatlakozón keresztül a lerakódott P-membránokra 3 ml 2,0 térf%-os glutáraldehid-oldatot (0,1 mól/l-es nátrium-kakodilát-pufferben, pH=7,2) juttatunk. Ezután 2.10s Pa túlnyomást létesítünk, ezzel a glutáraldehid-oldatot 20 °C-on 20 perc alatt átsajtoljuk a lerakódott P-membránokon és a 18 mikroszűrőn. A glutáraldehidben a molekula két végén két karbonilcsoport van, így a P-membránban található proteint tartalmazó molekulák lizinjének e-aminocsoportjaival bifunkcionális térhálósítószerként reagál. Abban az esetben, ha mindkét e-aminocsoport ugyanabban a proteint tartalmazó molekulában helyezkedik el, akkor ez a reakció intramolekuláris, míg ha a két e-aminocsoport két különböző, proteint tartalmazó molekulában helyezkedik el, akkor ez a reakció intermolekuláris. Néhányszor megismételt mosás után a 18 mikroszűrőből és a lerakódott és térhálósított P-membránokból álló ultraszűrő lényegében kész, és eltávolítható a 2 nyomás alatt működő berendezésből. Azonban a fenti módon készített ultraszűrő membránt tartalmazó 2 nyomás alatt működő berendezés közvetlenül is alkalmazható ultraszűrő egységként. A készített ultraszűrő membrán visszatartási jellemzőinek megállapítása céljából szűrési kísérleteket végeztünk 2.10s Pa nitrogén-túlnyomás alkalmazása mellett, különböző tesztmolekulákat alkalmazva, különböző pH-nál, a tesztmolekulák töltéssel nem rendelkeztek, azaz izoelektromos pontjuknál (IEP) dolgoztunk. Tesztanyagként a következőket alkalmaztuk: 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
