200686. lajstromszámú szabadalom • Eljárás reumás eredetű ízületi gyulladások kezelésére, vagy megelőzésére alkalmas, EPA-t és/vagy DHA-t tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 200686 B den egyes csapadék képződése és eltávolítása után a zsírsav koncentrációját megnöveljük az oldatban, az oldószer egy részének lepárlásával, majd folytatjuk a hűtési lépést Ily módon gyakorlatilag ugyanolyan kitermelés és tisztaság érhető el, különösen alacsony hőmérsékletek alkalmazása nélkül, mely utóbbi egy nagyobb léptékből végzett eljárásnál nehézségeket okozhatna. Előnyösen az EPA és DHA elválasztásához alkalmazott olaj a lehető legfrisebb, és ily módon az elválasztást a zsírsavak jelentős lebomlása előtt már elvégezhetjük. A találmány szerinti eljárás céljára alkalmas EPA és DHA magas koncentrációját tartalmazó természetes zsírok és olajok például a következők: tengeri állatok zsírjai és olajai, például makréla, szerdába, csuka és hering olaj, csukamájolaj és egyéb tengői állatok, például gamélarák-jellegű állatok olajai és zsírjai. Megjegyezzük azonban, hogy a találmány szerinti eljárás során bármely forrásból származó EPA és DHA alkalmazható. Előnyös, ha az olaj forrásául szolgáló hal a lehető leghidegebb környezetből származik. A deltaó-deszaturáz enzim, mely az eikoza-tetraénsavnak EPA-vá történő átalakulását katalizálja, optimális aktivitási hőmérséklete 90 *C. Ezért a hideg vizekből származó halak nagyobb mennyiségű EPA-t tartalmaznak, mint a melegvízi halak. Még nagyobb EPA-kitermelés érhető el olyan halakból, melyeket szabáylozott környezetben tenyésztettek. Ha a halat gamma-linolénsavban gazdag táplálékon tartjuk, 9 *C hőmérsékletű sós vízben, optimális mennyiségű EPA keletkezik. A természetes zsírt vagy olajat elszappanosítjuk vagy alkoholizisnek vetjük alá a triglicerideknek szabad zsírsavakká vagy zsírsav-észterekké történő átalakítására. Célszerű olyan módszert alkalmaznunk, melynek során nincs jelen erősen bázikus reagens, és a reakció hőmérséklete nem magas, mivel ezek peroxidációhoz és cisz-transz átrendeződéshez vezetnek. Az előnyös hidrolízis-módszer az enzimer hidrolízis, melynek során lipáz enzimet alkalmazunk 35-40 'C hőmérsékleten és 6-7 pH-értéken. A lipázt szokásos módon cisztein vagy aszkorbinsav nyomokkal aktiváljuk. Alipáznak elszappanosításra történő alkalmazása azért is előnyös, mivel a lipáz sztereospecifikus, és így nem bontja a transz-zsírsavakat, melyek a természetből a trigliceridből képződhetnek. így, még ha a kiindulási anyagban jelen is van transz-EPA vagy transz-DHA, azt a nem-elszappanosított anyaggal együtt eltávolítjuk, és nem lesz jelen a végtermékben. A természetes zsírok és olajok hidrolizálásának egy másik módszere a lipázzal vagy erős bázissal történő részleges hidrolízis. Ha lipázt alkalmazunk, az 1,5-2 órán át végzett hidrolízis, szemben a szokásos 6 órával, gazdagabb EPA-foirást biztosít, mivel a lipáz előnyösen a kezelt triglicerid első és harmadik elágazását távolítja el. Ismeretes, hogy természetes trigliceridekben a szélső elágazások magasabb fokban telített láncokat tartalmaznak, mint a középső lánc. így a hidrolízis fokának csökkentése automatikusan eltávolítja a telítettebb savak jelentős részét is. Kálium-hidroxid is alkalmazható a természetes zsírok és olajok részleges hidrolízisére. Ilyen esetben az olaj kiindulási anyagot 15-20 perc időtartamig kezeljük a kálium-hidioxiddal, a trigliceridek részleges hidrolizálására. Mint a lipáz esetében, ez a részleges 5 hidrolízis is gazdagabb EPA forrást biztosít, mivel a triglicerid első és harmadik lánca előnyösebben támadható a bázissal A részleges hidrolízis után a hidrolizis-elegyhez kénsavat vagy más, erős ásványi savat, például sósa- . vat vagy salétromsavat adunk a zsírsav-elegy elválasztásra. A zsírsavak elegye az elegy tetejére úszik, és az alsó, vizes fázist döntjük. Ez a részleges hidrolizis-lépés arra is alkalmas, hogy más, többszörösen telítetlen vegyületeket eltávolítsunk a trigliceridjeiktől, függetlenül a trigliceridek forrásától. A szabad zsírsavak clegyei természetes forrásuktól elválaszthatók átészterezési eljárással is. Azsürsavat tartalmazó anyagot, például tengeri állatból származó olajat száraz etanollal vagy száraz metanollal, és nyomnyi mennyiségű nátrium-fémmel visszafolyatás közben forraljuk. Ennek során az etil-, illetve metil-észtereket nyeljük, ezáltal a szabad zsírsavak megfelelő etil- vagy metil-észteieit felszabadítjuk a triglicerid molekulákból. Ez a módszer lényegesen enyhébb körülményeket igényel, mint a bázikus hidrolízis, més megkíméli a reakcióelegyet az erős körülmények által okozott sötétedéstől. Az észterek az extrakciós eljárás bármely lépésében a szabad zsírsavakká alakíthatók, önmagukben ismert hidnáizismódszerekkd. Bizonyos esetekben azonban kívánatos lehet közvetlenül az észterek alkalmazása anélkül, hogy azokat a szabad savvá alakítanánk. A következő lépésben a nem-elszappanosított anyagokat, például koleszterint, A és D vitaminokat és szénhidrogéneket szövés oldószerrel végzett mosással eltávolítunk. Éne a célra bármely szerves oldószer például petroléter, metilén-klorid, etil-éter stb alkalmazható. A szerves fázis elváalsztása után a vizes fázist megsavanyítjuk. Erre a célra bármely sav alkalmazható, bár előnyösen a gyógyászatiig elfogadható savak. Ennek során a szabad zsírsavak szerves fázisként elválnak. A vizes fázist elöntjük. Kis mennyiségű nátrium-klorid vagy más só hozzáadása jelentősen javítja az elválást Ezután a zsírsav elegyet karbamiddal kezeljük, és ily módon elválasztjuk a telített és mono-telítetlen zsírsavakat A katbamisod kezdés során a karbamidot olyan poláros, szerves oldószerhez adjuk, mely teljesen oldja a kaibamidot és a zsírsavakat egyaránt Ilyen megfelelő oldószer például a metanol, etand, izopropanol, petroléter, benzol, triklór-etilén és metil-izobutil-keton. Előnyösen etanolt alkalmazunk, mivel ilyen esetekben nem lép fel toxicitási probléma. A kaibamidot az oldószerben oldjuk, kívánt esetben melegítés közben, és így olyan kaibamid-oldatot kapunk, melynek karmabid-tartalma általában 10- 20%. Ezután a karbamid-oldatot és a zsírsav elegyet elegyítjük. Bár magát a zsírsav elegyet is adhatjuk a karbamid-oldathoz, előnyösen úgy járunk el, hogy a zsírsav elegyet először egy másik szerves oldószerben oldjuk, mivel ez a módszer bizonyos mértékben védi a zsírsavakat a karbamid-oldat magas hőmérsékletével szemben. A szabad zsírsavak pctroléterben vagy más, poláros oldószerben, például acetonban, etanolban vagy metanolban oldhatók. A karbamid-oldatot 1 tömegrész zsírsav elegyre vonatkoztatva legalább 0,5 tömegrész, előnyösen 1-4 tömegrész 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
