200615. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi szövetekben található plazminogén aktivátor és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 200615 B 2 két, amelyek mintegy 2160 bázispárt tartalmaztak, ismert módszerekkel összekapcsoltuk. Egy olyan plazmidot különítettünk el és jellemeztünk, amely a megfelelő irányítottsággal tartalmazta a három t-PA-t kódoló töredékeket. Ez a plazmid a pE342-t-PA jelölést kapta. Ezt a plazmidot feltártuk Sac II enzimmel, és bakteriális eredetű lúgos foszfatázzal (BRL) kezeltük. Ahhoz, hogy DHFR szekvenciát kapjunk (a termelésére vonatkozó szabályozó szekvenciákkal együtt), egy közelítőleg 1700 bázispárból álló töredéket készítettünk’ a pEHER plazmid SacII enzimmel végzett feltárásával. (A pEHER olyan plazmid, amely mutációs ŰÍÍFR-t termel, s a 459 151 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben lett leírva.) Ezt a töredéket hozzákapcsoltuk a pE342-t-PA plazmidhoz, és így a pETPAER4O0 plazmidot kaptuk, amely analóg á pEHER plazmiddal. azzal az eltéréssel, hogy a HBsAg kódoló tartomány a t-PA-tól származó cDNS szekvenciákkal lett helyettesítve. 2.B. A t-PA szekvencia kifejezése és felerősítése pETPAER400 (pETPER) plazmidot bevittünk dhfr“ CHO-DUX Bll sejtekbe és DHFR+ CHO-K1 (ATCC CCL61) sejtekbe Graham és Van der Eb módszerével (lásd fentebb). A transzformált dhfr sejteket glicin-, hipoxantin- és timidin-hiányos táptalajon végzett szaporítással választottuk ki. A transzformált DHFR+ sejteket legalább 100 nM metotrexát jelenlétében végzett szaporítással választottuk ki. A megfelelő kiválasztási táptalajon képződött telepeket klónozó gyűrűk alkalmazásával különítettük el, és ugyanolyan táp^&on több generációt hoztunk létre. ATelerősítéshez a telepekből számlázó sejteket részekre osztottuk, és olyan táptalajokra vittük át őket, amelyek óxlO4, 10-\ 2,5x105. 5xl05 és K/fnM metotrexátot tartalmaztak. A tenyésztést és az átvitelt többször megismételtük. A sejteket igen kis sejtsűrűség (102—103 sejt/lemez) mellett tenyésztettük 10 cm átmérőjű tálakban, és a kapott tenyészeteket elkülönítettük. 2.C. Vizsgálati módszerek A t-PA kifejezést az átfertőzött, felerősített tenyészetekben a plazminképződés közvetlen vizsgálatánál a fenti l.K részben ismertetett módszer alkalmazásával ellenőriztük. A DHFR és a t-PA szekvenciák együttes felerősítését úgy vizsgáltuk, hogy elkülönítettük a DNS-t a felerősített tenyészetek összefolyt monomolekuláris rétegeket 150 mm átmérőjű lemezeken összefolyt monomolekuláris rétegeket 50 ml steril PBS-sel mostuk, és elbontottuk 5 ml olyan oldat hozzáadásával, amely 0,1 % nátrium-dodecil-szulfátot, 0,4 M kalcium-klorid és 0.1 M etilén-diamin-tetraecetsavat (pH=8) tartalmazott. 5-10 perc elteltével az elegyet elválasztottuk, fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk. és etanollal kicsaptuk. A DNS-t ismét felszuszpendáltuk 150 mm átmérőjű lemezenként 1-1 ml olyan oldatban, amely 10 mM trisz-hidrokloridot (pH=8) és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazott. RN-áz enzimet adtunk hozzá 0,1 mg/ml koncentráció eléréséig, és az oldatot 30 percig inkubáltuk 37 °C-on. Nátrium-dodecil-szulfátot adtunk hozzá 0.1 % koncentrációig, valamint pronázt (Sigma) 0.5 mg/ml koncentrációig. 3-16 órán át inkubáltuk 37 °C-on, majd az oldatot ismét fenollal és kloroformmal extraháltuk, majd etanollal kicsaptuk. A DNS szemcsét 0,5 ml vízben szuszpendáltuk, és feltártuk restrikciós enzimekkel. Mintegy 5-10 [tg feltárt DNS-t vetettünk alá elektroforézisnek agaróz gélben [1 % agaróz trisz-acetát pufferoldatban (40 mM trisz, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav, ecetsavval 8,2 pH-értékre beállítva)] [Crouse és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 7887 (1982)]. Miután a brómfenolkék színezék a teljes távolság 2/3 részét megtette lefelé a gélben, a gélt eltávolítottuk, és megfestettük etidium-bromiddal. Miután a DNS-t ultraibolya fénnyel láthatóvá tettük, a gélről nitrocellulós szűrőkre vittük át Southern eljárásával [J. Mól. Bioi., 98, 503 (1975)]. A szűrőket ezután a pEHER plazmid 1700 bázispárból álló (a fentiek szerint készített és hibridizált) töredékből vagy a pETPER plazmid közelítőleg 1970 bázispárból álló Bgl II töredékből előállított, lefordított mintával hibridizáltuk. 3. A t-PA kifejezése vad típusú DHFR fehérjével együtt 3.A. A vektor kialakítása A pETPER plazmid kialakításával analóg módon állítottuk elő a PETPFR plazmidot, amely a vad típusú DHFR-t kódoló DNS szekvenciát tartalmazza. Kialakítását a fenti 2.A pontban ismertetett módon végeztük, azzal az eljárással, hogy a pEHER plazmid helyett a DHFR fehérje génszekvencia forrásként a pE342.HBV.E400.D22 plazmidot használtuk, amelyet a 100/92 számú Genentech találmányban írtunk le. (459 152 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amely a 117-058 sz. európai szabadalmi bejelentésnek felel meg.) A pE342.HBV.E400.D22 plazmid hasonló a pEHER plazmidhoz, kivéve, hogy egyetlen bázispár eltérés áll fenn a vad típusú és a mutációs DHFR között. A létrejött pETPFR plazmid minden tekintetben analóg a pETPER plazmidal, azzal az eltéréssel, hogy a mutációs DHFR-re vonatkozó kódoló DNS szekvenciát a vad típusú DHFR-t kódoló DNS szekvencia helyettesíti. 3.B. A t-PA szekvencia kifejezése A pETPFR plazmidot felhasználtuk a DHFR-ben hiányos CHO sejtek átfertőzésére (Urlaub és Chasin fentebb idézett munkája) Graham és Van der Eb kalciumfoszfátos kicsapási módszerének alkalmazásával. A szelektív táptalajon (-HGT) képződött huszonegy tenyészetet vizsgáltunk meg a plazminképződés kimutatásával. Ezt úgy végeztük, hogy megfigyeltük a fibrin feltárását fibrint és plazminogént tartalmazó agar-agar lemezen [Granelli-Pipemo és munkatársai, J. Exp. Med., 148, 223 (1978)]. A legerősebben pozitív kiónok közül négyet vizsgáltunk meg kvantitatíve a plazminképződést illetően, sejtekre vonatkoztatva, a fenti l.K pontban ismertetett módszerrel. A kvantitatív meghatározás során azt tapasztaltuk, hogy a vizsgált négy klón azonos vagy összemérhető t-PA kiválasztást biztosított a táptalajba. A kapott adatok dimenziója egység/sejt/nap volt. Alklónokat készítettünk oly módon, hogy két klónból beoltottunk -HGT táptalajt tartalmazó lemezeket. A kapott alklónok közül kettőt (18B és 1) vetettünk alá további analízisnek. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 IS
