200611. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az inzulin-prekurzorok diszulfidhíd-képzéssel történő előállítása során kapott reakcióelegyek feldolgozására, a helytelen rekombinánsok hasznosításával
1 HU 200611 B 2 A találmány új eljárás a teljes inzulinvázat tartalmazó inzulin-prekurzoroknak a megfeleli nyfltláncú, az inzulin A-láncot és az inzulin B-láncot a cisztein kénatomokon képezett S-szulfonátok alakjában tartalmazó előtermékből, valamely merkaptán jelenlétében, a nyfltláncú S-szulfonátot legfeljebb 10 mg/ml koncentrációban tartalmazó vizes közegben, 0 °C és 37 ”C közötti hőmérsékleten, 7 és 11 közötti pH-értéknél lefolytatott diszulfídhíd-kapcsolási reakció útján történő előállítása során kapott reakcióelegyek feldolgozására, a helytelen rekombinánsok elkülönítésével és újbóli hasznosításával; a talámány értelmében ezt a reakcióelegyet, kívánt esetben 1^100 mg/1 fiziológiailag ártalmatlan felületaktív anyag, előnyösen polietilén és/vagy polipropilén-glikol típusú, vízben oldódó polimer hozzáadása után, 4 és 6 közötti pH- értékre állítjuk be, a levált csapadékot elkülönítjük és szulfitolízis útján visszalakítjuk az inzulin A-láncot és inzulin B-láncot tartalmazó újbóli diszulfidhíd-képzési reakciónak alávethető S-szulfonáttá. Az említett inzulin-prekurzorok fent leírt módon, diszulfidhíd-képzéssel történő előállítása már ismeretes volt a 37 255 sz. európai szabadalmi leírásból, ahol ezeket a prekurzorokat az (I) általános képlettel ábrzolják; ebben a képletben R jelentése hidrogénatom, vagy kémiai vagy enzimes úton lehasítható aminosav-maradék, vagy pedig egy kémiai vagy enzimes úton lehasítható, legalább két aminosav-maradékból álló peptid-maradék; Y jelentése -LysB29-Z-B2B - és ebben Z jelentése Alá, Thr vagy Ser, mimellett az (A-l)-től (A-21)-ig terjedő híd egy inzulin-A-lánc, a (B-l)-től (B-30)-ig terjedő híd egy inzulin-B-lánc; X egy az (A-l) aminocsoportján az inzulin-A- lánchoz és a /B-30/ karboxilcsoportján az inzulin-B-lánchoz kapcsolódó híd, amely a természetes eredetű inzulin-prekurzorokban általában 30-35 aminosav-maradékot tartalmazó peptidlánc, például a humán proinzulinban -Arg-Arg-Glu-Glu-Ala-Asp-Leu-Gln-Val- Gly-Gln-Val-Glu- Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly- Ser-Leu-GIn-Pro-Leu-AIa-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GIn -Lys-Arg-. Ezeket az inzulin-prekurzorokat az idézett leírás szerint (II) általános képletű nyfltláncú, a ciszteinkénatomokon képzett S-szulfonátokat tartalmazó előtermékből - ahol R, X és Y jelentése egyezik a fent megadottal - állítják elő, oly módon, hogy valamely (II) általános képletű S-szulfonátot egy 7-11,5 pH- értékű és 10 mg/literig terjedő S-szulfonát koncentrációjú vizes közegben valamely merkaptán oly mennyiségével reagáltatnak, amely SSO3- egységenként 1-5 HS-csoportot ad. A diszulfidhíd-képzés hozam ebben az eljárásban több paramétertől, így a pH- értéktől, az SSO3- és -SH egymás közötti arányától, a koncentációtól, a merkaptán fajtájától, a hőmérséklettől és a reakció időtartamától is függ. A gyakorlatit megközelítő körülmények között az az eljárás kb. 60 7c diszulfidhíd-képzési hozamra optimalizálható. Más szóval, az idézett leírásban egy inzulin-prekurzomak diszulfidhíd-kapcsolás útján történő előállításáról van szó, amelynek során diszulfidhidak képzésével alakítják ki a három diszulfidhidat tartalmazó szerkezetet; ebből a prekurzorból azután proteáz enzimekkel való kezelés során a melléktermékként képződött helytelenül kapcsolódó inzulin-prekurzorok töredékekre bomlanak, amelyek azután már nem alakíthatók vissza az egyszerű módon a kívánt inzulinprekurzorokkl „Inzulin-prekurzorok” alatt itt mind proinzulinok, mind pre-proinzulinok értendők, mimellett a „pre” előtag a proinzulin N-terminusán jelenlevő egy vagy több további aminosavra vonatkozik, és maga a proinzulin-rész előnyösen az emberi vagy majom-proinzulin szekvenciájának felel meg. Elvileg természetesen más, hasnyálmirigyből elkülöníthető proinzulinok, például sertés-, marha- vagy juh- proinzulinok, vagy szintetikus, a humán-inzulin szekvenciát tartalmazó, gén-technológiai eljárásokkal előállított, illetőleg sertés-inzulin esetében félszintetikusan humán-inzulinná feldolgozható proinzulinok is tekintetbe jöhetnek. Ismeretes, hogy az inzulinnak nem mindegyik diszulfídja egyformán reakcióképes, hanem a diszulfid enyhe redukciója esetén először az A7 és B7 ciszteinek közötti diszulfidhíd nyílik fel, mielőtt még a B19 és A20 ciszteinek közötti második diszulfidhíd felnyílnék. Az A7 és B7 közötti diszulfidhíd elsőként bekövetkező redukcióját saját kísérleteinkben az inzulinprekurzor-S-szulfonát merkaptán csekély feleslegével történő reakciója alkalmával is megfigyeltük. A diszulfidhíd-képzés útján kapott inzulin-prekurzor további feldolgozása az irodalom szerint kromatográfiás eljárásokkal, például gélkromatográfiás sótlanítással, pl. SephadexW G25, majd ezt követően Sephadex G50 superfine gyantán történő gél-kromatográfiával folytatható le, amikor is a gél- kromatografálás második lépésében a natív inzulin-prekurzorok „aggregált alakjaitól” választják el a kívánt terméket, vö. pl. 37 255 sz. európai szab. leírás. Meglepő módon azt találtuk, hogy az inzulin-prekurzoroknak a megfelelő S-szulfonátokból történő diszulfidhíd-képzés során képződő helytelen rekombinánsok - amelyek részaránya általában a kiindulási mennyiség 30-50 %-a szokott lenni - 4 és 6 közötti pH- értéknél közvetlenül leválaszthatók a diszulfidhíd-képzési reakcióközegből, míg az inzulin-prekurzor natív alakja csaknem teljesen az oldatban marad. Ez fennáll abban az esetben, ha a diszulfidhíd-képzéshez mintegy 2 ekvivalens -SH csoportot alkalmazunk S-szulfonát-csoportonként, és abban az esetben is, ha valamivel nagyobb mennyiségű merkaptánt alkalmazunk, amikor is a ciszteincsoportok további redukciója és ezzel olyan inzulin-prekurzorok képződése következik be, amelyek csak részlegesen tartalmaznak diszulfid-hidakat. A csapadékot azután a szokásos módon, például centrifugálással elkülönítjük és a szulfitolízis útján a (II) általános képletnek megfelelő S-szulfonáttá alakítjuk át. Ez ezután újbóli diszulfidhíd-képzésnek vethető alá. A találmány szerinti eljárás a diszulfidhíd-kapcsolási összhozam növelését teszi lehetővé azáltal, hogy a helytelen rekombinánsokból álló (eddig kiselejtezett) melléktermék egyszerű eljárással, újrafeldolgozásra alkalmas minőségben és koncentrációban történő kinyerését teszi lehetővé, így ez a melléktermék technológiailag előnyös és gazdaságos módon a kiindulási prekurzor-származékokká alakítható vissza. A találmány szerinti elejárás során előnyös, ha a lecsapási reakcióközeghez a 4 és 6 közötti pH-érték 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
