200560. lajstromszámú szabadalom • Eljárás diagnosztikai célú tromboplasztin-reagens előállítására
3 HU 200560 B Példa: A. / Extrakció, tisztítás: 500 g friss nyúlagyból a kisagyat és a 5 nyúltagyat, továbbá a meninxeket eltávolítjuk, majd az agyállományt vértelenitjük. A vértelenitett agyat 1-2 cm-es darabokra vágjuk, ismételt vértelenitést végezve eltávolítjuk a maradék vérszennyezödést. Késes iq homogenizátorral 30 másodpercig keverést végzünk. A szövethomogenizátumot ezután 0,6 1 vizes oldattal (mely 5 g fenol, 1 ramol glutation, 0,1 mmol tokoferol 1 liter desztillált és 15 ionmentes vízben való oldásával kaptunk, a vizet előzőleg 30 percig argonnal vagy nitrogénnel oxigénmentesitjük) további 60 másodpercig homogenizáljuk. Ezt követően az elegyet 30 percig 37 °C-os vízfürdőben, majd 20 steril edényben 24 órán át 4 °C-on inkubáljuk, majd az elegyet 1500 g-vel 30 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A tromboplasztikus aktivitást tartalmazó anyag a centrifugátum felső kétharmadában található meg. Ez jól el- 25 különíthető, amelyet el is távolítunk és a továbbiakban 4 °C-on tartunk. B. / Reagens-készítés: 30 A megfelelő tromboplasztikus hatáB megválasztása céljából hatóanyagunkból fiziológiás sóoldat segítségével 10-100-szoros higítási sorozatot készítünk, majd a protrombin mérések alapján az optimális tromboplasztikus 35 aktivitást tartalmazó anyagot leosztva liofilizáljuk. A vizsgálatokhoz a liofilizált tromboplasztint desztillált víz segitségével rekonstruáljuk. 40 A protrombin-idő vizsgálatakor a nemzetközileg elfogadott rendszert alkalmazzuk: 0,1 ml reagens (elkészítése az előzőekben került ismertetésre), 0,1 ml nitráttal olvadásgátolt vizsgálandó plazma és 0,1 ml kálcium- 45 -klorid vizes oldata (15-25 mmol/l-es sarzsonként változóan). A fenti módon készített diagnosztikai készlet célszerűen 9 ampulla reagenst és 1 ampulla kálcium-klorid-oldatot tartalmaz. Min- 50 den dobozon kívánatos az ISI-értékek feltüntetése. Az Így elkészített tromboplasztin-reagenssel meghatározott protrombin-idö-kontroll: (egészséges egyének plazmáját vizsgál- 55 va) 12-17 másodperc közötti érték. C./ Az ISI meghatározása Az eljárás szerint készített reagenssel meghatározzuk normál és patológiás plazmák protrombin idejét. Ugyanezen plazmaminták protrombin idejét nemzetközileg standardizált tromboplasztin reagenssel is meghatározzuk. A protrombin időkből (normál és patológiás) protrombin rátákat számítunk (patológiás protrombin idő : normál protrombin idő), majd ezek logaritmusait képezzük. A két mérési sorozat végeredményét jelentős logaritmus értékek lineáris regressziós analízisét elvégezzük és a regressziós egyenes meredekségéből az ISI értékét meghatározzuk. Az ISI értéke preparátumonként változhat, tehát minden minta ISI-jét külön meg kell határozni. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás diagnosztikai célra alkalmas, nagytisztaságú tromboplasztin-tartalmú reagens-sorozat előállítására, állati szövet vértelenitése, homogenizálása, oldószeres extrahálása, az inkubált elegy centrifugával történő elválasztása, a felülúszóból higítási sorozat készítése és az oldatok liofilezése útján, azzal jellemezve, hogy a kiindulási anyagként használt szővet-homogenizátumot 0,5-2,5 : : 0,7-3,0 tömegarányban 0,5-5,0 g/1 fenolt, 0,1-2,0 mmol/1 glutationt és 0,01-0,2 mmol/1 tokoferolt tartalmazó, inert gázzal oxigénmentesített, ionmentes vizes oldatban 20-40 percen át 35-40 °C-on inkuhálással aktiváljuk, az elegyet 20-30 órán át 2-8 °C-on hűtve tároljuk, majd az inkubált elegyet ismert módon centrifugálva szétválasztjuk, a felülúszóból ismert módon fiziológiás sóoldattal higítási sorozatot készítünk, majd a kapott nagytisztaságú reagens-mintákat ismert módon liofilizáljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szövet-homogenizátum extrahálásánál 0,9-1,1 : 1,1-1,3 szővet-folyadék-tömegarányt alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aktiválásra használt vizes oldatban a fenol koncentrációját 5 g/1, a glutation koncentrációját 1 mmol/1 és a tokoferol koncentrációját 0,1 mmol/1 értéknek választjuk. Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest - A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető R 4951 - KJK 90.3117.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató 4
