200488. lajstromszámú szabadalom • Eljárás de-mannozil-teikoplanin-származékok előállítására
1 HU 200488 B 2 kitermelés 30 mg tiszta DM-TA2-5, azaz olyan (I) általános képletű vegyület amelyben: R = N-(9-metil-dekanoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport; Rí = N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport; R2 = hidrogénatom. A tiszta DM-TA2-5-nek az 1. példában leírttal azonos körülmények között rögzített NMR spektrumának jellegzetes csúcsait a II. táblázatban mutatjuk be. A 3. pontban leírttal azonos körülmények között rögzített FAB tömegspektrum 1891-es molekulatömeget mutat, ami egyezik a hozzá rendelt szerkezettel. Egy analóg kísérletben, amelyben a Norcadia orientalis NRRL 2450 törzset Streptomyces Candidas NRRL törzzsel helyettesítjük, hasonló eredményeket kapunk. 5. A de-mannozil teikoplanin komplex 1. komponensének (DM-TA2-1) előállítása Az 1. példában leírt körülmények között dolgozva Nocardia orientalis NRRL 2450 törzzsel, de a beoltás után 24 órával TA2-2 helyett 400 mg TA2-l-et adagolva olyan fermentlevet kapunk, amelyet az 1. példában leírt módon dolgozunk fel. A fermentlében az átalakítás hatásfoka 28 százalék. A kinyerést és tisztítást az 1. példában leírttal azonos módon végezzük. Az előzővel azonós körülmények között végzett HPLC analízis a TA2-l-re 22,58 perces RT értéket mutat és 23,98 percet a DM-TA2-l-re. A kitermelés 55 mg tiszta DM-TA2-1, azaz olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben: R = N-(Z-4-decenoil)-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport; Rí = N-acetil-béta-D-2-dezoxi-2-amino-glükopiranozil csoport; R2 = hidrogénatom. A 3. példában leírttal azonos körülmények között rögzített FAB tömegspektrum 1713-as molekulatömeget mutat, ami egyezik a hozzárendelt szerkezettel. 6. A de-mannozil teikoplanin komplex 2. komponensének (DM-TA2-2) előállítása Egy liofilezett Nocardia orientalis NRRL 2450 törzset tartalmazó csövet kinyitunk, és aszeptikusán átoltjuk egy zabliszt agar ferdére. 7 napig 28 °C-on inkubáljuk, majd a kinőtt tenyészetet desztillált vízben szuszpendáljuk és 2 db, 100-100 ml következő összetételű, S/bis jelű vegetatív táptalajra oltjuk: Élesztőkivonat 4 g Pepton 4 g Glükóz 10 g MgS04 0,5 g KH2PO4 2 g K2HPO4 4 g Desztillált víz 1000 ml-re pH sterilezés után: 7 A beoltott táptalajt 48 órán át 28 °C-on rázatjuk 200/perc fordulatszámú körkörös rázógépen. A kapott tenyészetet 5-5 ml-es részekre osztjuk, lefagyasztjuk és további felhasználásig tároljuk. A lefagyasztott tenyészetből 2,5 ml-rel oltunk 100 ml S/bis vegetatív táptalajt tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombikot. A tenyészetet 48 órán át 28 'C-on rázatjuk 200/perc fordulatszámmal, 5 cm-es kitéréssel. Az így kapott tenyészet 5 ml-ével oltunk 100 ml C jelű termelő táptalajt (500 ml-es lombikban), összetétele a következő: glükóz® 2 g/1 élesztőkivonat 5 g/1 aszparagin 1,5 g/1 MgSÜ4 0,5 g/1 CaCC>3 5 g/1 NaCl 0,1 g/1 CaCl2xH20 0,1 g/1 nyomelem oldat® 1 ml/1 pH sterilezés után: 6,9 (a) a glükózt külön sterilezzük (b) a nyomelem oldat összetétele: bórsav 0,50 g/1 CuS04x5H20 0,04 g/1 KI 0,10 g/1 FeCl3x6H20 0,20 g/1 MnS04xH20 0,40 g/1 FeSC>4x7H20 0,40 g/1 ammónium-molibdát 0,20 g/1. A fenti eljárással harminc lombikot készítünk. 24 óra elteltével a micéliumot centrifugálással kinyerjük, kétszer mossuk izotóniás sóoldattal (vizes NaCl 1:1000 tömegarány), majd újra szuszpendáljuk 3 1 fiziológiás oldatban (ugyanilyen térfogatú termelő táptalaj) és 200 mg TA2-2 szubsztrátot (azaz a teikoplanin komplex 2. komponensét) adunk mindegyik lombikhoz és a fermentációt a hozzáadás időpontjától számított 96 órán át aerob módon folytatjuk. A fermentlé HPLC vizsgálata azt mutatja, hogy a TA2-2 35 százaléka DM-TA2-2-vé alakul. A 30 lombikban lévő összes reakcióközeg pH-ját 10,5-re állítjuk 1 N NaOH hozzáadásával, majd szűrési segédanyaggal leszűrjük. A szűrlet pH-ját IN HC1 hozzáadásával 7,5-re állítjuk, majd 500 ml Sepharose-epsí/on-aminocaproil-D-Alanyl-D-Alanine affinitás-gyantát (122 969 sorszámú EPA bejelentés) adunk hozzá. A keveréket éjszakán át 4 'C-on kevertetjük. A gyantát ezután elválasztjuk a kimentett fermentlétől, majd kromatográfiás oszlopba töltjük. Az oszlopot öt gyanta térfogatnyi Tris-HCl pufferrel (0,05 M, pH 7,5), majd ugyanilyen mennyiségű Tris bázis oldattal (0,05 M) mossuk. A gyantát ezután 1 %-os ammonium hidroxid oldattal eluáljuk és 100 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciókat hangyasavval semlegesítjük, majd az 1. pontban meghatározott körülmények között HPLC-vel analizáljuk. A fenti körülmények között a TA2-2 retenciós ideje (RT) 24,71 perc, míg a DM-TA2-2 RT-je 26,30 perc. A DM-TA2-2 tartalmú frakciókat egyesítjük, majd ultraszűréssel betöményítjük 90 mm-es Hi-Flux U-F Cell Millipore-t használva, amelyben 1000 dalton névleges molekulatömeg-határú PCAC Pellicon ultraszűrő membrán van. Az oldat térfogatát lecsökkentjük, és a maradékot liofilezve 2965 mg nyers DM-TA2-2-t kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
