200487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új demetil-avermektin-származékok előállítására
] HU 200487 B 2 a 25-ös helyzet R szubsztituens jelentése a fenti. A „demetil-avermektinek” kifejezést olyan A és B típusú avermektinek megnevezésére használjuk, ahol a diszacharid rész 3’- és/vagy 3” helyén kapcsolódó egyik vagy mindkét szubsztituens hidroxilcsoport. Az itt leírt mutánsok kiemelkedő jelentőségűek a találmányban szereplő és példákban szemléltetett nemtermészetes demetil-avermektinek előállítása szempontjából. Különösen fontosak az olyan előnyös demetil-avermektinek előállításánál, mint például azok a vegyületek, ahol a 25-ös szénatom szubsztituense 4-6 szénatomszámú cikloalkilcsoport. A Streptomyces avermitilis avermektint termelő mutánsait különféle ismert mutagén kezeléssel állíthatjuk elő: ultraibolya fénnyel, Röntgen sugárral történő besugárzás, N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidines, etil-metán-szulfonátos, salétromsavas és nitrogén-mustáros, például N-metil-bisz(2-klór-etil)-aminos vagy hasonló kezelés. A mutagenezist végezhetjük a természetes avermektineket termelő S. avermitilis. például az S. avermitilis ATCC 31272 spóráin vagy vegetatív tenyészetén. Az elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok szelektálására használt, jól ismert módszer az a biokémiai vizsgálati eljárás, mely lehetővé teszi nagy számú véletlenszerű mutagenizált baktériumtelep átvizsgálását. A módszer azon alapszik, hogy termelődik-e jelzett széndioxid az elágazó láncú [l4C-l]-2-oxosavból vagy nem [Tábor és munkatársai, J. Bact., 128: 485-486 (1976)]. Az eljárás abból áll, hogy a mutánst mikrotiter lemez lyukában növesztjük alkalmas tápközegben, a sejteket toluoilal permeabilizáljuk, majd [,4C-l]-2- -oxosavat (pl. 2-oxo-izokapronsavat) adunk minden tenyészethez, és vizsgáljuk a felette lévő légtérben a l4CŰ2 megjelenését. A [14C-l]-2 -oxo- izokapronsav helyett használhatunk [l4C-l]-2-oxo-3-metil-valeriánsavat vagy [ ,4C-1J-2- oxo-3-metil-vajsavat is. A l4CC>2 termelődését alkalmas módon úgy mutatjuk ki, hogy az egyes lyukak fölé megnedvesítetett bárium-hidroxidos szűrőpapírt helyezünk, mely minden l4C02-ot megköt, és a jelzett bárium-karbonátot, ha egyáltalán keletkezett, autoradiográfiával kimutatjuk. Az elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok autoradiogrammja a vak kontroll aktivitása körüli radioaktivitást mutat, vagyis a mutáns nem képezett jelzett bárium-karbonátot. Az itt szereplő mutánsok morfológiai sajátosságai és a tenyészetük jellemzői általában véve a 4 429 042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírtakkal azonos. A mutánsok megkülönböztető tulajdonsága, hogy nem rendelkeznek az elágazó láncú-2-oxosav-dehidrogenáz aktivitással, mely tulajdonságot a leírtak alapján határozzuk meg. Az említett aktivitás hiányának következménye, hogy a mutánsok nem termelnek természetes avermektineket. ha olyan definiált táptalajon tenyésztjük őket. mely nem tartalmaz RCOOH általános képletű - ahol R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butilcsoport - zsírsavakat. vagy a megadott zsírsavakká a fermentáció során átalakulni képes vegyületet. Az American Type Culture Collection által irányított rendszertani vizsgálatok megerősítik, hogy a fenti l4C02 vizsgálat alapján kiválasztott 1-3 és HL-026 mutáns törzsek tulajdonságai szoros rokonságot mutatnak a 4 429 042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírt ATCC 31272 szülőtörzzsel, de bizonyos tulajdonságokban eltérnek. így az 1-3 mutáns (ATCC 53567) lényegesen kevesebb spóraláncot képez, mint az ATCC 31272 törzs, a HL-026 törzs (ATCC 53568) pedig gyakorlatilag nem képez légmicéliumot és spórákat, de az a nagyon kevés spóralánc, amit képez, hasonló jellegű, mint az ATCC 31272 törzsé. Kétséges, hogy a HL-026 mutáns hasznosítja-e a rafinózt, mint kizárólagos szénforrást, míg az ATCC 31272 törzs és az 1-3 mutáns erre képes. (A szabadalmaztatok kísérleteiben egyik törzs sem látszott növekedni rafinózon). A HL-026 mutáns törzs egy további tulajdonsága, hogy kevesebb melanin pigmentet termel, mint a másik két törzs, sőt tirozinos agaron egyáltalán nem termeli a színanyagot. Végül, a 4 429 042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban az ATCC 31272 törzsre megadott leírással ellentétben nem tudtunk növekedést kimutatni olyan táptalajon, mely szénforrásként kizárólag szacharózt tartalmazott. A Streptomyces avermitilis 1-3 és HL-026 törzseket a Budapesti Egyezmény szerint helyeztük el az American Type Culture Collection-ban (amerikai törzsgyűjtemény) (Rockville. Maryland, USA) Streptomyces avermitilis ATCC 53 567, illetve ATCC 53568 megnevezés alatt. Ha a találmány szerinti mutánsokat megfelelő primer vegyületet tartalmazó táptalajon tenyésztjük, (I) általános képletű vegyületek keverékét termelik, ahol az (I) általános képletben R jelentése megfelel az alkalmazott primer vegyületnek. Négy termék keletkezhet, melyeket a 4 429 042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom jelölését alkalmazva „R”-avermektin Al, A2, B1 és B2 elnevezéssel illetünk, ahol „R” természetesen a 25-ös helyzetű szubsztituenst jelenti. így például, ha R jelentése ciklopentilcsoport, a négy lehetséges avermektin: triviális név R1 R3 ciklopentil-avermektin A1 hidrogénatom CH3 ciklopentil-avermektin A2 hidroxilcsoport ch3 ciklopentil-avermektin B1 hidroxilcsoport H ciklopentil-avermektin B2 hidroxilcsoport H Szinefungin jelenlétében a megfelelő demetil-avermektin keletkezik. Általában megfigyelhető, hogy a demetil-avermektin A komponens mennyisége csökken és a demetil-avermektin B komponensé nő. Az (I) általános képletű vegyületet. ahol megvan a kettős kötés és hiányzik a hidroxilcsoport, alternatív módon előállíthatjuk a megfelelő (I) általános képletű vegyületből, ahol R1 jelentése hidroxilcsoport és a kettős kötés hiányzik, dehidratációs reakció útján. A reakció előtt szelektíven védjük az 5-ös és 4” helyzetű hidroxilcsoportokat, például t-butil-dimetil-szilil-oxi-acetil származékot képezve, majd szubsztituált tio-karbonil-halogeniddel, például (4-metil-fenoxi)-tio-karbonil-kloriddal regáltatunk, amit magas forráspontú oldószerben, például triklór-benzolban történő melegítés követ, hogy a vízkihasadás megtörténjen. A védőcsoportok eltávolítása után megkapjuk a telítetlen vegyületet. Ezt a reakciót a megfelelő reagensekkel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
