200438. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metionin-szulfoxid-csoportot tartalmazó peptidek és fehérjék redukálására
9 HU 200438 B 10 4. példa IGF-I, Met (Of1 * 3 kezelése 0,90 mg IGF-I, Met(0)5»-t 0,90 ml vízmentes trifluor-ecetsavban feloldunk. A peptidoldatot nyolc 100 |d-es alikvotra osztjuk. Az 1, 2, 7 és 8 számú mintákat a kezelés előtt N2-gázáramban megszárltjuk. Mindegyik mintapár (azaz az 1-es és a 2-es, 3-as és 4- -es, 5-08 é6 6-os, 7-es és 8-as) azonos kezelést kap, azzal a kivétellel, hogy a páros számú mintákat a vizsgálat előtt ciszteinil-S-szulfonát-származékká alakítjuk át. A mintákhoz különböző mennyiségű vízmentes trifluor-ecetsavat, dimetil-szulfidot és tömény sósavat adunk. Az így kapott oldatokat erőteljes összekeverés után szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Néhány minta további koncentrált sósav mennyiséget kap 30 perccel a kezdeti sósavhozzáadás után. A 30 vagy 60 perc reakcióidő végeztével a reakció leállítását az összes mintánál 0,1%-os vizes trifluorecetsav-oldattal történő hígítással vagy a semlegesített oldatok szulfitolizise révén hajtjuk végre. A kémiai módosítás mértékét nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével, DuPont Cs Reliance, 0,6 x 4 cm-es fordított fázisú oszlop alkalmazásával hatá- 5 rozzuk meg. A kromatográfiás analízist 0,1 mólos, 7-es pH-jú ammónium-foszfát pufféiban 45 °C-on végezzük, az elúcióhoz lineárisan növekvő CHaCN-gradienst alkalmazva. A mennyiségi elemzést a 214 nm-nél jelentkező 10 abszorpciós csúcsok területének mérésével végezzük. A trifluor-ecetsav(dimetil-szulfid)sósavas kezelése az IGF-I, Met(0)5#-nek egy olyan peptidet eredményezett, amelynek kromatográfiás retenciós ideje a szintetikus 15 úton előállított standard IGF-I-ével megegyező volt. A vizsgálat eredményeit az alább következő 4. táblázaton mutatjuk be. 20 25 4. táblázat IGF-I, Met(0]P redukciója Minta száma Trifluor-ecetsav, Ml Sósav konc., n Dimetil-szulfid, konc. m Idó, perc Redukciófok % IGF-I hozama % H 0 0 0 0 0 _ 21 0 0 0 0 0-3 100 0,1 1 30 80 672 4 100 0,1 1 30 80 Ö93 5 100 0,2 1 60 93 562 6 100 0,2 1 60 97 863 7 0 4,4 0,5 30 6,9 1* 8 0 4,4 0,5 30 10 4,53 1Kontroll ^Diszulfidként meghatározva 3Szulfitolizis után S-szulfonát alakjában meghatározva 7
