200367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás indanomicin és homoindanomicin, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 200367 B 2 növesztett tenyészetéről készített spóraszuszpenzióval 2 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100-10Ó ml 1. példában megadott összetételű, R-jelű táptalajt oltunk, majd a lombikokat síkrázógépen (270 fordulat/perc, 3,5 cm kitérés) 28 'C-on rázatjuk 48 óráig. Ezután a két lombik tenyészetével 10 1-es üvegfermentorban 5 liter steril F-jelű táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő: Glükóz 2,0 % burgonya-keményítő 2,0 % szójaliszt 2,5 % kazein-hidrolizátum (10 %-os oldat) 2,0 % kukoricalekvár (50 % szárazanyag tartalom) 0,2 % napraforgóolaj 0,4 % kalcium-karbonát 0,5 % csapvízben. A táptalaj pH-ját In nátrium-hidroxid oldattal 7,0- 7,2-re állítjuk, majd 121 °C-on 1 órán át sterilezzük. A fermentációt 28 'C-on végezzük 300 liter/óra levegőztetés és 375 fordulat/perc kevertetés mellett Habzás esetén polipropilén- glikolt adagolunk. A fermentáció 120. órájában 550 mg/ml antibiotikum koncentrációt mérünk a fermentlében az 1. példában leírt módon. Ezután a fermentlé pH-ját 4-es értékre állítjuk telített oxálsav oldattal, majd a fermentlét szűrjük. A szűrletet kétszer 500 ml etil-acetáttal extraháljuk és az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük. A kiszűrt mikroorganizmus sejteket háromszor 1,5 liter metanollal kivonatoljuk, a metanolos kivonatokat egyesítjük és a metanolt csökkentett nyomáson, 50 °C-on lepároljuk. A vizes maradék pH-ját telített oxálsavval 4-es értékre állítjuk, majd a megsavanyított oldatot kétszer 500 ml etil-acetáttal extraháljuk. A kapott etil- acetátos kivonatokat és a fermentlé szűrletetének etil-acetátos extraktumát egyesítjük, vízmentes nátrium-szulfáton szántjuk, és vákuumban bepároljuk. A kapott olajos bepárlási maradékot 100 ml n-hexánnal eldörzsöljük, és hidegen egy napig állni hagyjuk. Ezután a kivált csapadékot leszűrjük, így 4,1 g nyersterméket kapunk. A kapott nyersterméket 200 g Kieselgel (szemcseátmérő: 0,05-0,2 mm, Reanal, Budapest) adszorbenst tartalmazó oszlopon kromatografáljuk. Az elúciót 1,5 liter n-hexán-kloroform (1:1) eleggyel, majd 1,0 liter kloroformmal, végül 1,5 liter kloroformmetanol (1:1) eleggyel végezzük. Az oszlopkromatográfiás frakciók antibiotikum tartalmát vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel analizáljuk [adszorbens: szilikagél G (Reanal, Budapest), kifejlesztő elegy: etil-acetátkloroform-metanol (2:1:0,3) elegy, előhívás foszformolibdénsav reagenssel]. Az oszlopról n-hexán- kloroform (1:1) eleggyel először homoindanomicin, majd homo-indanomicin és indanomicin keveréke oldódik le, s végül kloroform, illetve kloroform-metanol (1:1) eleggyel az indanomicin. A megfelelő frakciókat vákuumban bepárolva 475 mg homoindadomicint, 1,3 g indanomicint és 430 mg homoindanomicinből és indanomicinból álló keveréket kapunk. A keveréket preparatív rétegkromatográfiás módszerrel választjuk szét, szilikagél G adszorbenst és az oszlopkromatográfiás frakciók vizsgálatánál alkalmazott kifejlesztő elegyet használva. így további 80 mg homoindanomicint és 202 mg indanomicint kapunk. A kromatográfiásan tiszta antibiotikumokat diklórmetánban oldjuk, az oldatot 2n sósav oldattal, majd vízzel mossuk, végül szárítjuk és vákuumban bepároljuk. Az így tisztán sav formában kapott antibiotikumokat acetonitrilből krisztályosítjuk át. A homoindanomicin fizikai és spektroszkópiai adatai: Op.: 84-87 'C Optikai forgatóképesség:[a]D20 = -360’ (c=0,5, CHCI3) Elemanalízis: C: H: N: számított: 75,6 % 8,48 % 2,76 % talált: 74,2 % 9,1 % 2,85 % Ultraibolya színkép (metanol): Xmax nm (EiCm1%): 245 (610), 252 váU (599), 291 (325). Infravörös spektrum, jellemző sávok (KBr, cm-i): 3245, 2965, 2935, 1710, 1635, 1410. 'H-NMR spektrum, jellemző jelek (CDCI3 8, ppm): 2,84 (H-2), 4,17 (H-3), 4,38 (H-7), 5,4-6,0 (H-9, 10, 11, 12, 13, 14), 6,87 (H-23), 6,25 (H-24), 7,04 (H-25), 0,93 (H-27, 32), 0,69 (H- 29), 0,79 (H-30). 13C-NMR spektrum (CDCI3, 5, ppm): 179,5 (C-l), 49.3 (DEPT:CH) (C-2), 73,3 (C-3), 22,8 (C-4), 26,1 (C-5), 29,1 (DEPT:CH) (C-6), 76,0 (C-l), 140,0 (C-8), 122,4 (C-9), 126,5 (C- 10), 132,5 (C-ll), 46,4 (C-12), 129,4 (C-13, C-l4), 49,7 (C-15), 43,6 (C-16), 29.6 (C-17), 26,9 (C-18), 40,9 (C-19), 52,9 (C-20), 191.6 (C-21), 132,9 (C-22), 116,7 (C-23), 109,8 (C-24), 125,5 (C- 25), 27,4 (C-26), 12,5 (C-27), 22,6 (C-28), 13,0 (C-29), 12,2 (C- 30), 22,7 (DEPT:CH2) (C-31), 12,5 (DEPT:CH3) (C-32). Tömegspektrum Molekulatömeg: 507 Jellemző ionok: m/z (R.I.%): 507 (37), 478 (7), 420 (3), 413 (5), 265 (56), 94 (100). Az indanomicin fizikai és spektroszkópiai adatai: Op.: 146-149 'C Optikai forgatóképesség:[a]D20= -338° (c=l; CHCI3) Elemanalízis: C: H: N: számított: 75,42 % 8,78 % 2,84 % talált: 75,45 % 8,97 % 2,61 % Ultraibolya színkép (metanol): Xmax nm (Eicm1%): 243 (691), 249 váll (677), 289 (340). Infravörös spektrum, jellemző sávok (KBr, cm-1): 3240, 2965, 2940, 1710, 1625, 1410, 1215, 760. 1 H-NMR spektrum, jellemző jelek (CDCI3, 8, ppm): 2,85 (H-2), 3,90 (H-3), 4,20 (H-7), 5,2-6,0 (H-9, 10, 11, 13, 14), 6,95 (H-23, 25), 6,25 (H-24), 0,95 (H-27), 0,75 (H-29), 0,85 (H- 30), 1,15 (H-31, d, J = 6,5 Hz). 13C-NMR spektrum (CDCI3, 8, ppm): 179,4 (C-l), 41.4 (C-2), 75,0 (C-3), 22,1 (C-4), 26,5 (C-5), 30,6 (C-6), 74,8 (C- 7), 140,7 (C-8), 124,6 (C-9), 127,4 (C-10), 132,6 (C-ll), 45,5 (C-12), 129,6 (C-13, 14), 50.0 (C-15), 43,8 (C-16), 29,7 (C-17), 27,2 (C-18), 40,7 (C-19), 52,7 (C-20), 192,0 (C-21), 132,6 (C- 22), 116,3 (C-23), 110,4 (C-24), 125,6 (C-25), 27,4 (C-26), 12,6 (C-27), 22,1 (C-28), 13,6 (C-29, 30), 14.0 (C-31). Tömegspektrum 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
