200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 a 4,4’-dimetoxi-tritil-csoport kimutatására 10 %-os, vizes kénsavval permetezzük be a gélt, és 60 *C hőmérsékletre hevítjük). A reakció leállítására 1 ml vizet adagolunk, és az oldószert csökkentett nyomáson desztilláljuk. A piridint toluollal együtt ledesztilláljuk, a hexamert 5’-végén 8 ml benzol-szulfonsavval hasítjuk, ahogy azt a 4 és 2 trimerek előállításakor megadtuk. A 10 terméket szilikagél oszlopon tisztítjuk (Merck 60 H, 3,5 x 5 cm). Az eluálást lépésenként végezzük, kloroform és metanol 98 : 2, illetve 95 : 5 arányú elegyeivel. A 10 vegyül,etet tartalmazó frakciókat szárazra desztilláljuk. Hasonlóképpen eljárva, az 5 trimert összekapcsoljuk a ó vegyülettel, majd a teljesen védett terméket szilikagélen közvetlenül tisztítjuk. Ez utóbbi vegyületet 3’-végén hasítjuk a 9 fragmens előállításakor megadott módon trietil-amin, piridin és víz elegyében. Végül a 9 és 10 hexamereket 2 ml vízmentes piridinben összekapcsoljuk, kondenzálószerként 75 mg (0,225 mmól) 2,4,6- triizopropil-benzol-szulfoniltetrazolt használva. A reakció 4 órán át tart szobahőmérsékleten. A reakcióelegyet desztilláljuk, és a desztillációs maradékot szilikagélen kromatografáljuk. A 160 mg súlyú, II terméket úgy kapjuk meg, hogy petrol-éterrrel kicsapjuk oldatából. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint a termék homogén. 20 mg 11 vegyületet 0,5 ml piridinben oldunk, és 7 ml tömény ammónium-hidroxiddal lehasítjuk a védőcsoportokat. A reakciót 8 órán át 60 °C hőmérsékleten végezzük. Ezután 15 percen át szobahőmérsékleten 80 %-os ecetsavval kezeljük. Az ecetsavat desztillációval eltávolítjuk, és a szilárd halmazállapotú maradékot 4 %-os, vizes ammonium- hidroxid-oldatban oldjuk (4 ml), és háromszor 2 ml etil-éterrel extraháljuk. A vizes fázist 1-2 ml térfogatúra töményítjük, és az oldat egy részét a 12 vegyület tisztítására nagynyomású folyadék kromatográfiával frakc ionáljuk. A legnagyobb csúcsot adó frakciókat (2,0 OD254 egység) összegyűjtjük, és körülbelül 5 ml térfogatúra töményítjük. A 12 végterméket sómentesítjük Biogel P-2 1,5 x 100 cm méretű oszlopon, az eluálást 20 %-os, vizes etanollal végezve. Az oldószer eltávolítása után 200 pl vízben oldjuk az anyagot, amikor az oldat az alábbi elnyelést adja: A254 : 10. A 12 termék szekvenciáját kétdimenziós szekvencia-analízissel bizonyítjuk. A komplett timozinal gént a 16 szintetikus oligo-nukleotidból állítjuk elő szomatosztatin [Itakura és munkatársai (1977), lásd előbb] és a növekedési hormon [Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544 (1979)] előállítása kapcsán megadottak szerint eljárva. 10 pg T2-T15 oligo-nukleotidot kvantitatíve foszforilezünk (gamma-P32)-ATP-vel (New England Nuclear) T4 polinukleotid kináz jelenlétében [Goeddel és munkatársai (1979), lásd előbb], amikor körülbelül 1 Ci/mmól specifikus aktivitású terméket kapunk. A radioaktívan jelzett fragmenseket 20 % poliakrilamid/7 mól karbamid gélen elektroforézist végezve tisztítjuk, az eluált fragmensek szekvenciáját kétdimenziós elektroforézis/homokromatográfiával bizonyítjuk [Jay és munkatársai, Nucleic Acids Res., I, 331 (1974)]. A fragmenseket analízis előtt kigyóméreg-enzimmel részlegesen emésztjük. A Ti és Ti6 fragmenseket nem foszforilezzük, mivel így minimumra csökken a következő ligációs reakciók során a szükségtelen polimerizáció. 2-2 pg foszforilezett oligó nukleotidot 4—4 fragmenst tartalmazó 4 csoportban összekapcsolunk T4 dezoxi-ribonukleinsavligázzal, ismert módon [Goeddel és munkatársai (1979), lásd előbb], A folyamatot a mellékelt 7. ábrán mutatjuk be. A reakciótermékeket 15 % poliakrilamidot és 7 mól karbamidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk [Maxam és Gilbert, PNAS, USA, 71, 3455 (1977)]. A 4 izolált terméket összekapcsoljuk, és a reakcióelegyet 10 % poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve különítjük el. A timozinal génnek megfelelő nagyságú (90-105 bázispár) dezoxi-ribonukleinsavat elektro-elúcióval különítjük el. 0,5 pg pBR322 plazmidot BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázzal kezelünk, és a fragmenseket poliakril-amid gél-elektroforézissel különítjük el. A gélről elektroelucióval nyert nagy fragmenst ligáljuk a szintetikus dezoxi-ribonukleinsavhoz [Goeddel és munkatársai, 1979, lásd előbb]. Az eleggyel E. coli K12 294 törzset transzformálunk (a törzs ATCC száma: 31446). A transzformációs elegy 5 %-át 20 pg/ml ampicillint tartalmazó LB- lemezeken szélesztjük. Az ampicillinre rezisztens telepek tetraciklinre érzékenyek, ez a tetraciklin rezisztencia génbe való beépülést jelzi. A telepek sejtjeiből nyert plazmidok analízise szerint a pTHal jellel jelzett plazmidok tartalmazzák a következőket: egy Bgin helyet, amely a pBR322 plazmidban nincs jelen, azaz beépült az 5. ábrán megadottak szerint a timozinal gén; egy 105 bázispárból álló fragmenst, amit a BamHI és EcoRI hasítással kapunk. A mellékelt 7. ábrán megadjuk a pTHal plazmid előállításának módját, a vastagon kihúzott végek az 5’-foszfát-csoportokat jelentik. 3) A kezelt pTHal és a LE' (d) fragmens reakciója A pTHal plazmid tartalmaz egy ampicillin rezisztenciát meghatározó gént, és egy strukturgént; ez utóbbi gén egy EcoRI helyre az 5’-kódoló szál végén, és egy BamHI helyre a 3’-végén van klónozva. A timozin gén tartalmaz továbbá egy Bgin helyet is. Az LE’ (d) fragmenst felvevő plazmid előállítására a pTHal dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd ezután a Klenow polimeráz I enzimmel reagáltatjuk TTP jelenlétében, és dATP-vel az EcoRI vég feltöltésére. A BglII enzimmel való emésztést követően ampicillin rezisztencia gént hordozó lineáris dezoxi-ribonukleinsav ffagmenshez jutunk, ez az ellenkező végeken ragadós BglII szakaszt hordoz, és egy tompa véget. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat olyan LE’ (d) fragmenssel zárjuk körré, amely BglII ragadós véget és egy tompa véget hordoz. A recirkulációt T4 ligázzal végezzük, ezután megkapjuk a pTRp24 plazmidot. Ugyanakkor, a tompa vég ligációjának helyén újra visszaáll egy EcoRI restrikciós enzim által felismerhető szakasz. E) A pSOM7A2A4 plazmid előállítása A pTrp24 plazmidot BglII és EcoRI enzimmel emésztve, az elegyet poliakril-amid gél-elektroforézissel tisztítva, és a fragmenseket elektro-elúcióval izolálva olyan fragmenshez jutunk, amely tartalmaz LE’ (d) polipeptidet meghatározó kodonokat, BglII ragadós véget és EcoRI ragadós véget 3’-véghez 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
