200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 C i A pUC8 plazmid emésztése Hindi enzimmel Az emésztést a 2. példa A) pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC222 plazmid és a Hphl és PstI restrikciós enzimek, és az ezekhez tartozó reakcióelegyek helyett a pUC8 plazmidot [beszerezhető az alábbi helyen: Bethesda Research Laboratories, 8717 Grovemont Circle, RO. Box 6009, Gaithersburg, MD 20877], továbbá Hindi restrikciós enzimet, és az alábbi restrikciós enzimes reakcióelegyet használjuk: 50 mmól nátrium- klorid, 10 mmól trisz-hidroklorid, pH = 7,5, 10 mmól magnéziumklorid, 1 mmól ditio-teritol. A kapott Hindi enzimmel emésztett pUC8 plazmidot további tisztítás nélkül használjuk fel. D) A 3’-egyszálú szakasz feltöltése T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal A Hphl emésztés után hátramaradt 3’-szakaszt tompa végligációval töltjük fel. Úgy járunk el, hogy 1 pg Hphl enzimmel emésztett pIT104 plazmidot 10 pl alábbi összetételű elegyben inkubálunk 37 °C hőmérsékleten, 5 percen át: 33 mmól trisz-hidroklorid, pH = 7,8, 67 mmól kálium-acetát, 10 mmól magnézium-acetát, 0,5 mmól ditio-treitol, 0,1 mg/ml marha szérum albumin, 150 - 150 pmól dCTP, dATP, dGTP és dTTP, végül 3 egység T4 dezoxi- ribonukleinsav-polimeráz. A reakció leállítására 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 1 pl, 50 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav-oldatot adagolunk. E) Ligálás és az E. coli K12 RRlAMI5/pKC307 törzs előállítása A tompa végére kiegészített pIT104 plazmid és a pUC8 emésztett plazmid ligálását Maniatis és munkatársai által ismertetett ligációs eljárással végezzük [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb]. A kapott plazmidot pKC307 jellel jelöljük, a plazmiddal E. coli K12 RR1AM15 sejteket transzformálunk a 2. példa B) pontjában megadottak szerint. A szelekciót a 3. példa C) pontja szerint végezzük. A kapott E. coli K12 RRlAM15/pKC307 transzformánsokat a pKC307 plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük. A pKC307 plazmiddal például az alábbi törzseket transzformálhatjuk a 2. példa B) pontjában megadottak szerint eljárva: E. coli KI2, E. coli K12 RR1, E. coli K12 JA221 vagy E. coli K12 HB101. A pKC307 jelű plazmid restrikciós térképét a mellékelt 4. ábrán adjuk meg. Előállítjuk a pKC307 plazmid funkcionális származékát is úgy, hogy a plazmidból kihasítunk egy 1,7 kb nagyságú Hindin fragmenst. A kapott plazmidot pKC308 jellel jelöljük, és E. coli K12 JA221 sejteket transzformálunk vele. Ez tovább szemlélteti a találmány szerinti plazmidokat. 7. példa A plTl25 plazmid és az E. coli K12 JA22JlpIT125 törzs előállítása 1) A plA7A4 AJ plazmid előállítása A) A pBRHtrp plazmid előállítása A pGMl plazmid hordozza a ALE1413 deléciót tartalmazó E. coli triptofán operont [Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 1457 - 1466 (1978)], és így olyan proteint határoz meg, amely fúziós proteinként honiozza a trp vezető szakasz első 6 aminosavát, és a trp E polipeptid utolsó harmadát (ezt a továbbiakban LE’ jellel jelöljük), továbbá a teljes tip D polipeptidet. Mindezek a trp promoteroperátor rendszer szabályozása alatt állnak. Az E. coli K12 W3110tna2trpA102/pGMl törzset letétbe helyeztük az American Type Culture Collection törzsgyűjteményében ATCC 31622 sorszámon. A törzsből ismert módon izolált pGMl plazmidot az alábbiakban megadott eljárás során használjuk. 20 pg plazmidot PvuII restrikciós enzimmel hasítunk, az enzim a plazmidot 5 helyen vágja. A génfragmenseket ezután EcoRI linkerekkel kapcsoljuk (a linker az alábbi szekvenciájú, önmagával komplementer oiigonukleotidot tartalmazza: pCATGAATTCATG. A későbbi klónozáshoz a plazmid EcoRI hasítási helyeket fog tartalmazni. A 20 pg-nyi mennyiségű, pGMl plazmidból kapott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 10 egység T4 dezoxi- ribonukleinsav ligázzal kezeljük, 20 pikomól 5’-foszforilezett, szintetikus pCATGAATTCATG oligo-nukleotid jelenlétében, és 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz-pufferral. Ennek összetétele a következő: 20 mmól trisz, pH = 7,6, 0,5 mmól adenozin-trifoszfát, 10 mmól magnézium-klorid, 5 mmól ditio-treitol. A reakciót egy éjszakán át végezzük 4 °C hőmérsékleten. Ezután 10 percen át 70 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, a ligálás befejezésére. A linkereket EcoRI emésztéssel hasítjuk, és az EcoRI végekkel rendelkező fragmenseket 5 % poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel elkülönítjük. A három legnagyobb fragmenst izoláljuk a gélről oly módon, hogy először etidium-bromiddal festjük, és a fragmensek helyét ultraibolya fénnyel lokalizáljuk. A megfelelő helyről kivágjuk a gélt. A géldarabokat 300 pl, 0,1X TBE-elegybe helyezzük, majd dializáló zsákba töltjük és 1 órán át 100 V feszültségkülönbség mellett elektroforézist végzünk. Az elektroforézis közege 0, lXTBE-puffer. A TBE-puffer az alábbi összetételű: 10,8 g trisz-bázis, 5,5 g bórsav, 0,09 g dinátrium- etilén-diamin-tetraecetsav 11 vízben. A vizes oldatot összegyűjtjük a dializáló zsákból, fenollal, majd ezután kloroformmal extraháljuk, végül nátrium-klorid koncentrációját 0,2 mólra állítjuk be. Ezután etanolos kocsapással elkülönítjük a dezoxi-ribonukleinsavat, és vízben oldjuk. Az EcoRI ragadós végekkel rendelkező, trp promoter/operátor rendszert tartalmazó gént az alábbiakban megadott eljárással azonosítjuk. Az eljárás során a fragmenseket egy tetraciklin érzékenységet hordozó plazmidba építjük be, amely a promoter/operátor rendszer beépítését követően tetraciklinre rezisztens lesz. Ezután megadott dezoxi-ribonukleinsav fragmens izolálásokat poliakril-amid gél-elektroforézist követő, fentiekben ismertetett elektroeluciós módszerrel végezzük. B) A trp promoter!operátor rendszer szabályozása alatt tetraciklin rezisztenciát meghatározó pBRH trp plazmid előállítása és a fenti A) pont szerint izolált, trp promoter!operátor rendszert tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav fragmens azonosítása és sokszorosítása A pBRHl plazmid [előállítására vonatkozóan lásd Rodriguez és munkatársai. Nucleic Acids Research, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
