200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 nátrium-acetát- oldatot adagolunk, ezt úgy állítjuk el<5, hogy 3 mól nátrium- acetátot a lehetó legkevesebb vízben oldjuk, az oldat pH-ját 4,8- re állítjuk be jégecettel, és ezután 1 1-re állítjuk be a végtérfogatot Enyhén keverjük az oldatot 60 percen át 0 *C hómérsékleten tartjuk az elegyet, és a kivált dezoxiribonukleinsavat 5 percen át centrifugálva ülepítjük, ezután majdnem teljesen tiszta felülúszót kapunk. 0,4 ml felülúszót egy másik centrifugacsóbe juttatunk, 1 ml hideg etanolt adagolunk, és 30 percen át -20 "C hómérsékleten tartjuk az oldatot. A kivált csapadékot 2 percig centrifugálva összegyűjtjük, és a felülúszót leszívjuk. Az így összegyűjtött csapadékot 100 pl alábbi összetételű elegyben oldjuk: 0,1 mól nátrium-acetát és 0,05 mól trisz-hidrogén-klorid, pH = 8,0. Az oldatot 2 térfogat hideg etanol adagolásával újra kicsapjuk. 10 percen át -20 *C hőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, a csapadékot elkülönítjük centrifugálással. Az agaróz gélen végzett elektroforézis [Rao és Rogers, 1978, mint előbb] szerint a csapadék tartalmazza a pKC222 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. 2. példa A pIT123 plazmid és az E. coli K12 JA221/pIT123 előállítása A) A pKC222 plazmid Hphl-Pstl fragmensének izolálása 50 pg pKC222 dezoxi-ribonukleinsavat emésztünk 100 pl alábbi összetételű elegyben, 20 New England Biolab. egység Hphl restrikciós endonukleázzal: 6 mmól kálium-klorid, 1 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 10 mmól magnézium-klorid, 1 mmól ditio-treitol; az oldatot IX Hphl oldatnak nevezzük. Az emésztés teljessé válását elektroforézissel ellenőrizzük 2 % reakcióelegyet használva, agaróz gélen. Megfelelő mennyiségű, 5 mólos nátrium-kloridoldat adagolásával 60 mmól-ra állítjuk be a nátrium-klorid koncentrációt, és ezután 20 egység PstI restrikciós endonukleázt adagolunk. Az emésztés teljességét ismét agaróz gél-elektroforézissel ellenőrizzük. Ismert módszereket használva [Schlief és Wensink, Practical Methods in Molecular Biology, Springer-Verlag, New York (1981)] akril-amid gélről izoláljuk a 325 bázispárból és az egyszálú véggel rendelkező Hphl-Pstl fragmenst. A tisztított 325 bázispárból álló fragmenst E. coli dezoxi- ribonukleinsav polimeráz I nagy fragmenssel [New England Biolabs.] kezeljük. Úgy járunk el, hogy 1,5 pl (1 pg) fragmenst, 0,5 pl 10X-puffert (0,5 mól trisz, pH = 7,5, 0,1 mól magnézium- klorid), 0,5 pl (200 mmól) dCTP, dATP, dTTP és dGTP-t, továbbá 1 pl, 1 egység enzimet tartalmazó dezoxiribonukleinsav polimeráz I nagy fragmens-oldatot (Klenow-fragmens) elegyítünk, és az elegyet 15 percen át 37 ”C hőmérsékleten inkubáljuk. A polimeráz enzimet hővel inaktiváljuk, majd ezután BamHI linkereket adunk az elegyhez Roberts és Lauer szerint eljárva [Methods in Enzymology, 68, 473 (1979)]. A BamHI linkért tartalmazó dezoxi- ribonukleinsavat ismert módon BamHI restrikciós enzimmel emésztjük IX BamHI só-oldatban (0,15 mól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,9, 6 mmól magnézium-klorid). Ezután az oldat trisz-hidrogén-klorid koncentrációját 100 mmól-ra növeljük, megfelelő mennyiségű, 2 mólos trisz-hidrogén-klorid- oldat (pH = 7,4) adagolásával, majd ezt követően a dezoxiribonukleinsavat EcoRI restrikciós enzimmel tovább emésztjük. A kapott, hasított dezoxi-ribonukleinsavat 7 % akril-amid gélen elektroforézissel tisztítjuk, és a 250 bázispárból álló fragmenst az előzőkben megadottak szerint eljárva izoláljuk. B) A pIT122 plazmid és az E. coli KI2 JA221lpJT122 előállítása 2 pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat BamHI és ezután EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk, a 2. példa A) pontja szerint eljárva. Az enzimet 70 *C hőmérsékleten 5 percen át inkubálva inaktiváljuk, majd 1 pl (1 pg) pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat 1 pl (1 pg) tisztított, 250 bázispárból álló fragmenssel, 37 pl vízzel, 5 pl (10 mmól) adenozin-trifoszfáttal, 5 pl ligációs eleggyel (0,5 mól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8, 0,1 mól ditio- treitol, 0,1 mól magnézium-klorid), és 1 pl T4 dezoxi- ribonukleisav ligázzal (körülbelül 100.000 New England Biolabs, egység) elegyítünk. 2 órán át 15 *C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, és ezután 5 percen át 70 °C hőmérsékleten tartva leállítjuk a reakciót Jégfürdőben lehűtjük az elegyet és a kapott ligációs eleggyel Wensink szerint eljárva transzformálunk [Wensink (1974), lásd előbb]. A transzformált E. coli K12 JA221 (NRRL B-15211) sejteket 200 pg/ml ampicillint tartalmazó TY agaron izoláljuk. Az izolálandó transzformánsok azonosságát a várt fenotípus (Amp1*, Tets) vizsgálatával végezzük, megvizsgáljuk továbbá a megfelelő EcoRI-BamHI fragmenst. A kapott E. coli K12 JA221/pIT122 transzformánsokat a pIT122 plazmid izolálására ismert módon tenyésztjük. C) A pKC222 plazmid 1,45 kb nagyságú EcoRI fragmensének kapcsolása az EcoRI enzimmel emésztett pIT122 plazmidhoz 20 pg pKC222 és pIT122 plazmidot egymástól függetlenül különböző reakcióelegyekben 40 egység EcoRI restrikciós enzimmel hasítunk. A 200 pl térfogatú reakcióelegyek (IX EcoRI reakcióelegy) összetétele a következő: 0,1 mól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,5, 0,05 mól nátrium-klorid, 0,005 mól magnézium-klorid. Az 1,45 kb nagyságú EcoRI fragmenst ismert módon 7 % akril-amidot tartalmazó gélről izoláljuk, és ligáljuk az EcoRI enzimmel hasított pIT122 dezoxi-ribonukleinsavval. A kapott, összekapcsolt dezoxi-ribonukleinsavat pIT123 jellel jelöljük, és E. coli K12 JA221 (NRRL B-15211) sejteket transzformálunk vele. A ligálást és transzformációt a 2. példa B) pontjában megadottak szerint végezzük. Az ampicillin rezisztens transzformánsokat az 1,45 kb nagyságú EcoRI fragmens megfelelő orientációjának bizonyítására restrikciós enzimmel (EcoRI) végzett hasítással és agaróz gél-elektroforetikus analízissel bizonyítjuk. Az első 9 bázispár kivételével a teljes aph(4) gént tartalmazó plazmidokat pIT123 jellel jelöljük. Az E. coli K12 JA221/pIT123 transzformánsokat a pIT123 plazmid előállítására és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
