200366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított higromicin rezisztencia gén előállítására
1 HU 200366 B 2 A találmány higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó módosított génre vonatkozik. A módosított gén klónozásra, promoterek izolálására és jellemzésére, továbbá megfeleld gazdasejtek-domináns szelektálható markerekként műkő- 5 dó fuzionált gének előállítására használható. A találmány tárgya továbbá a fenti dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó vektorok és transzformánsok előállítása. A 2 100 738. számú nagy-britanniai közzétételi irat ismerteti a kiindulási anyagokat, többek között 10 a pKC222 plazmidot, és az ebben levő higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, amelyeket a jelen leírásban megadott eljárások során használunk. A fenti közrebocsátási irat azonban nem ismerteti a 15 jelen találmány tárgyát képező módosított gént, és nem szól ennek felhasználásáról, szelekciót lehetővé tevő fuzionált gének előállítására. Domináns, szelektálható markerrel végzett génfúzió alkalmas módszer transzkripciós vagy transzlációs 20 aktivációs szekvenciák izolálására, és így a domináns, szelektálható genetikai jelzés kifejezésére idegen sejtekben. Mivel igen sok szervezet érzékeny az amino-glükozid-típusú higromicin B antibiotikummal szemben, [Ahmad és munkatársai, Antimicrob. Agents 25 Chemother., 18, 789 (1980); Mann és munkatársai, Antibiot. and Chemother, 3, 1279 (1953); Pettinger és munkatársai, Antibiot. and Chemother., 3, 1268 (1953); és Singh és munkatársai, Nature, 277, 146 (1979)], a módosított, higromicin B antibiotikummal 30 szembeni rezisztenciát meghatározó gén értékes domináns, szelektálható genetikai maiker különböző gazdasejt rendszerekben. A találmány szempontjából érdekes, hogy a higromicin B foszfotranszferáz utolsó 338, 339 vagy 35 340 aminosava természetes szekvenciában leírja a higromocin B foszfotranszferáz enzim összes aminosavát, kivéve a természetben előforduló enzim molekula N-terminális végének első és második, vagy első, második és harmadik aminosavát. 40 Az alábbiakban bizonyos kifejezéseket definiálunk. Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor autonóm replikálódó molekula, például, de nem kizárólag plazmid, amely dezoxi-ribonukleinsav moR2n I CCT i i i GAA 1 1 1 CTC J 1 1 ACC 1 1 1 GCG ACG 1 I 1 i R3n i i i GGA 1 1 1 CTT 1 1 1 GAG 1 1 1 TGG i 1 ! CGC 1 i 1 TGC LYS PRO GLU LEU THR ALA THR ATC 1 1 1 GAA i i i AAG 1 1 i TTC GAC > 1 1 AGC 1 1 1 GTC 1 I 1 1 1 1 TAG i f i CTT 1 1 1 TTC 1 1 1 AAG 1 1 1 CTG 1 ! 1 TCG 1 i 1 CAG ILE GLU LYS PHE ASP SER VAL TCG i 1 1 GAG i i i GGC i i i GAA 1 1 i GAA i ! 1 TCT 1 1 1 CGT 1 i 1 1 I 1 AGC 1 1 1 CTC I 1 1 CCG 1 1 1 CTT 1 1 1 CTT 1 1 1 AGA 1 1 1 GCA SER GLU GLY GLU GLU SER ARG lekulához egy vagy több, további dezoxi- ribonukleinsav-szegmenst kapcsoltunk, vagy kapcsolhatunk. Transzformáció: dezoxi-ribonukleinsav bejuttatása befogadó gazdasejtbe, amiután megváltozik a genotípus, és változás következik be a befogadó sejtben. Fúnkcionális polipeptid: kinyerhető, biológiailag aktív, teljes méretében idegen polipeptid vagy prekurzor, kinyerhető, biológiailag aktív, idegen eredetű polipeptidből, és homológ polipeptid egy részéből vagy teljes egészéből álló polipeptid vagy kinyerhető, biológiailag inaktív, fúziós polipeptid, amely egy idegen eredetű polipeptid-részből, és egy biológiai szempontból inaktiváló, homológ polipeptidből áll, amely utóbbi specifikusan hasítható. Fúzionált géntermék: kinyerhető, idegen eredetű polipeptid, amely összekapcsolódott egy homológ polipeptid adott részével, vagy teljes egészével. Strukturgén: funkcionális polipeptidet meghatározó dezoxi- ribonukleinsav, amely nem tartalmazza a transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciákat. A találmány tárgya eljárás a higromicin B foszfotranszferáz enzim utolsó 338 aminosavát meghatározó dezoxi-ribonukleinsav- szekvenciát önmagában vagy transzlációs leolvasási fázisban egy transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciát tartalmazó génnel, vagy egy gén részével együtt tartalmazó plazmid előállítására. A plazmid előállítására a pKC222 plazmid 1,45 kb nagyságú EcoRI restrikciós fragmensét hozzákapcsoljuk a pIT122 plazmid EcoRI enzimmel emésztett alakjához, amikor megkapjuk a pIT123 plazmidot A találmány vonatkozik a fenti dezoxi- ribonukleinsavakat tartalmazó transzformánsokra is. Részletesebben, a találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza a transzlációs aktivációs szekvenciát meghatározó gént, vagy egy gén részének dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját. A találmány a fenti dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorokra és transzformánsokra is vonatkozik. Még részletesebben, a találmány szerinti dezoxiribonukleinsav az alábbi dezoxi-ribonukleotid-szekvenciájú: TCT 1 1 1 GTC J 1 1 GAG 1 t 1 AAG 1 1 I TTT i i i Rm 1 Rm LYS CTG 1 I 1 1 1 1 AGA I 1 1 CAG t 1 1 CTC 1 1 1 TTC i i i AAA 1 1 1 GAC SER VAL GLU LYS PHE LEU TCC 1 1 1 GAC 1 1 1 CTG 1 1 1 ATG 1 1 I CAG i i i CTC 1 1 1 I > 1 AGG i 1 l CTG 1 1 I GAC i 1 1 TAC i i i GTC 1 1 1 GAG SER ASP LEU MET GLN LEU GCT 1 1 1 TTC i 1 1 AGC I 1 t TTC 1 1 1 GAT 1 1 1 CT A GTA 1 i i 1 1 1 CGA 1 1 1 AAG 1 1 I TCG 1 1 1 AAG 1 1 1 CAT ALA PHE SER PHE ASP VAL 2
