200342. lajstromszámú szabadalom • Enzimatikus eljárás L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfinil)-vajsav előállítására
HU 200342 B sebességgel 10 percig centrifugáltuk, így 20 ml nyers enzimoldatot kaptunk felülúszóként. 2. egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértünk 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB oldatot (Koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes kereskedelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/1 trisz-hidroklorid oldatot (pH = 8,5). A kapott oldat OMPB- koncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 °C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban meghatároztuk az LAMPB-tartálmát aminosav elemzővel. Úgy találtuk, hogy 15 mg/ml L-AMPB keletkezett. 3. A kapott L-AMPN-tartalmú felülúszó oldat 100 ml-ét a 4. példa 3. lépése szerint kromatogafáltuk egy400 ml-es oszlopon, amely töltetként Dowex 50 W x 2 (H+-forma) kationcserélő gyantát tartalmazott, amelyet vizes ammónia oldattal fejlesztettünk ki. Az L-AMPB-tartalmú frakciókat a 4. példa 3. lépése szerint kezeltük, így 74 ml L-AMPB-t kaptunk fehér por formájában. 7. példa 1. Streptomyces lividans 66 törzzsel (PERM BP- 737 beoltottunk 10 ml, a 4. példa 1. lépése szerinti előzetes tápközeget. A tenyésztést rázógépen 24 óra hosszat 28 °C-on folytattuk. A kapott tenyészetet 2% koncentrációban oltótenyészetként alkalmaztuk a termelő tenyésztéshez, amelyet a 4. példa 1. lépése szerint, 28 °C-on, levegőztetés és keverés mellett 3 napig folytattunk. 2. Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértünk 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB oldatot (koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes, kereskedelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/l-es trisz-hidroklorid oldatot (pH = 8,5). A kapott oldat OMPB-koncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 °C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban meghatároztuk az L-AMPB-tartalmaz aminosav elemzővel. Úgy találtuk, hogy 6 mg/ml L-AMPB keletkezett. 8. példa 1. Streptomyces hygroscopicus SF-1293 törzzsel (PERM BP-130, ATCC 21705) beoltottunk 10 ml, a 4. példa 1. léppése szerinti előzetes tápközeget. A tenyésztést rázógépen 24 óra hosszat 28 °C-on folytattuk. A kapott tenyészetet 2% koncentrációban oltótenyészetként alkalmaztuk a termelő tenyésztéshez, amelyet a 4. példa 1. lépése szerint, 28 °C-on levegőtetés és keverés mellett 3 napig folytattunk. 2. Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértünk 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB oldatot (koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes, kereskedelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 10 ml 1 mól/l-es trisz-hidroklorid oldatot (pH = 8,5). A kapott oldat OMPB-koncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 °C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban meghatároztuk az L-AMPB-tartalmaz aminosav elemzővel. 17 Úgy'tállltuk, hogy 7 mg/ml L-AMPB keletkezett. 3. A kapott L-AMPB-tartalmú felülúszó oldat 100 ml-ét a 4. példa 3. lépése szerint kromatografáltuk egy 400 ml-es oszlopon, amely töltetként Dowex 500 x 2 (H+-forma) kationcserélő gyantát tartalmazott, amelyet vizes ammónia oldattal fejlesztettünk ki. Az L-AMPB-tartalmú frakciókat a 4. példa 3. lépése szerint kezeltük, így 350 mg LAMPB-t kaptunk fehér por formájában. 9. példa 100 ml 50 mmól/l-cs trisz-hidroklorid-pufferben (pH = 8,5) szuszpendáltunk 20 g kereskedelmi sütőélesztőt (Saccharomyces ccrevisae, Orientál YEAST Co., Japán gyártmány). Egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba bemértünk 20 ml sejtszuszpenziót, 30 ml vizes OMPB oldatot (koncentráció 87 mg/ml, pH = 7,0), 40 ml vizes, kereskdelmi nátrium-L-glutamátot (koncentráció 170 mg/ml) és 101 mól/l-es trisz-hidroklorid-oldatot (pH = 8,5). A kapott oldat OMPB-koncentrációja 26 mg/ml. Az enzimatikus reakciót 24 óra hosszat 37 *C-on enyhe rázás mellett hagytuk lefolyni. Ezután a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a kapott felülúszó oldatban meghatároztuk az L-AMPB-tartalmaz aminosav elemzővel. Úgy találtuk, hogy 6 mg/ml L-AMPB keletkezett. 10. példa 400 fjLg/ml OMPB-t és 600 gg/ml L-glutaminsavat tartalmazó 50 mmól/l-es trisz-hidroklorid-pufferben (pH = 8,5) feloldottunk 40 egység/ml kereskedelmi glutaminsav-oxálecetsav-transzaminázt (GOT, Bohringer Mannheim Co. gyártmány). Az enzimtikus reakciót 24 óra hosszat 37 °C-on hagytuk végbemenni, majd a reakcióoldatot 3 percig 100 °C-ra melegítettük. Ezután a reakcióoldat pH-ját hígított kénsavval 2 értékre állítottuk, majd centrifugálással eltávolítottuk az oldhatatlan szilárd anyagot. A kapott felülúszó L-AMPB-tartalmát aminosav elemzővel határoztuk meg. Aminosav elemzőként az ATTO CORPORATION japán gyártmányú MLC-703 típust használtuk, amelyen a retenciós időt 12 percre állítottuk be. Azt találtuk, hogy a kapott feiülúszó oldat L-AMPB-tartalma 100 gg/ml. 11. példa 1. Tenyésztés A N-X. táblázatban felsorolt mikroorganizmusokkal ferde tenyészetről 10 ml, nagy térfogatú tesztkémcsövekbe töltött folyékony tápközegeket oltottunk be, amelyeknek az összetétele 0,5% glükóz, 0,3% élesztőkivonat, 1,0% húskivonat, 1,0% pepton, 03% nátrium-klorid, pH = 7,0.Azaktinomiceták tenyésztéséhez egy-egy darab rozsdamentes acélrugót is helyeztünk a csövekbe. A tenyésztést rázatás közben 28 °C-on 24 óra (vagy 48 óra) hosszat végeztük. 2. Sejtminták készítése Tenyésztés után a kapott tenyészközegből egyegy ml-t (illetve gombák esetén 0,2 mii j) mikrokémcsövekbe helyeztünk (Eppendorf CC. gyártmány) és 12000 fordulat/perc sebességgel 3 'percig centri-1 \ \ \ • '} \ 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
