200342. lajstromszámú szabadalom • Enzimatikus eljárás L-2-amino-4-(hidroxi-metil-foszfinil)-vajsav előállítására
HU 200342 B 13 14 Alkalmazott Szubsztrát Amino-donor '' " Reakciótermék enzim és vegyület és vegyület és és termelt mennyisége mennyisége mennyisége mennyisége ,ig/ml jtg/ml pig/ml OMPB 100 NADL+NH4CI L-AMPB 1,9 1000 GLDH (60 egység/ml) 2-KG 100 NADH+NH4CI Glu 109,3 (kontroll) 1000 Amint az I. táblázatból látható, az enzimatikus reakcióról az OMPB-ből L-AMPB képződött, bár az L-AMPB kitermelése jelentős volt, azonban nem olyan magas, mint a glutaminsav képződése a 2-keto-glutársavból. 2. példa AII. táblázatban megadott baktériumtörzsekkel 40 ml táptalajokat oltottunk be, amelyeket Difco tápközegből készítettünk, majd a tenyésztést 28 °C- on 6 óra hosszat végeztük. A kapott tenyészeteket oltótenyészetként használtuk és 2%-ban alkalmaztunk 40 ml ugyanolyan tenyészközeg beoltására, 15 amelyet 28 °C-on egy éjszakán át tenyésztettünk, és OMPB-t adagoltunk 100 gg/ml koncentrációban minden tenyészethez. Ezután amino-donorként minden tenyészethez nátrium-L-aszparátot adagoltunk 100 (jLg/ml koncentrációban. Az enzimati- 20 kus átalakulást 28 °C-on 24 óra hosszat hagytuk lefolyni, majd a reakcióközeg pH-ját 25 °C-os kénsawal 2 értékre állítva leállítottuk a reakciót. A sejteket centrifugálással távolítottuk el. A képződött L-AMPB mennyiségét a felülúszó oldatokban 25 aminosav analizátorral határoztuk meg. A tesztek eredményét a II. táblázatban foglaltuk össze. II. Táblázat Vizsgált baktérium törzs Termel L-AMPB mennyisége (|ig/ml) Nyers enzimoldat (xlO'3egység/ml ) GOT aktivitása fikus GOT aktivitása Enzim (xl0‘3 egység/mg protein) sped-Bacillus subtilis (ATCC 6633) 2.4 22.0 46,7 Micrococcus luteus (ATCC 9341) 1.9 22.0 196.4 Staphylococcus Aureus 209 P 26.6 17.5 1823 (ATCC 6538) Escherichia coli (ATCC 10798) 0.8 3.8 5.4 Pseudomonas aeruginosa 83 342.0 686.7 (ATCC 10145) Serratia marcescens (ATCC 13880) 5.0 45.6 300.0 AII. táblázatból látható, hogy az AMPB jelentős kitermeléssel képződik OMPB-ből. A fenti módon kapott tenyészetek részleteit ultrahang kezelésnek vetettük alá, így elroncsoltuk a baktériumsejteket és sejtextraktumot kaptunk. A sejtextraktumokat lecentrifugáltuk, így nyers enzimoldatot kaptunk. A kapott nyers enzimoldatok GOT-aktivitását szintén meghatároztuk és a II. táblázatban feltüntettük. Amint a II. táblázatból látható, összefüggés figyelhető meg a termelt L-APMB mennyisége és a nyers enzimoldat GOT-aktivitási értéke között. Emellett a nyers enzimoldat fehéije tartalmát is meghatároztuk BioRad protein vizsgáló módszerrel, és az oldatban jelenlévő enzim specifikus GOT aktivitását számítottuk (x 10'3 egység) (preotein) és a II. táblázatban feltüntettük. 65 3. példa Streptomyces hygroscopicus SF-1293 törzzsel (FERM BP-130) beoltottunk 10 ml előzetes tenyészközeget (összetétele 2,0% oldható keményítő, 1,0% polipepton, 0,3% húskivonat, 0,05% dikálium-hidrogén-foszfát, pH = 7,0). A törzset 28 #C- on 24 óra hosszat rázató tenyészetben tenyésztettük. A kapott tenyészetet oltótenyészetként 2% mennyiségben tenyésztő tápközeg beoltására használtuk (összetétele 7,0 glükóz, 4,4% bactosoyton (Difco Co., USA gyártmány), 0,327% kálium-dihidrogén-foszfát, 0,052% dinátrium-hidrogénfoszfát, 1,15% dotiteTES, azazN-trisz(hidroxi-metil)-metil-2-amino-etánszulfonsav, 0,0001% kobalt-klorid, pH = 6,0) és a tenyésztést 28 °C-on levegőztetés és keverés mellett végeztük. 4 nap múlva a mikróba sejteket centrifugálással elválasztot-50 55 60 8
