200257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarpatogén fonálférgek tömegtenyésztésére és biológiai védekezőszerként való alkalmazásukra
D HU 200257 A 6 alakul ki szemben azokkal a módszerekkel, ahol egy korábbi tenyészet mindenféle fejlődési alakot tartalmazó részével végzik a beoltást. Mivel a tenyésztés célja uz infektiv lárvaalak minél nagyobb arányának elérése gazdaságos időtartam alatt, célszerű a tenyészetek életciklusának befolyásolása. Ismert, hogy a tápanyagforrós kimerülése olyan élettani változást eredményez a fonálférgek életciklusában, amely az infektiv lárvaalak arányának emelkedéséhez vezet a többi fejlődési alak rovására (a fejlődési ciklus ennél az alaknál megszakad). Az életciklus célszerűen befolyásolható a tápanyag megvonásával, a hőmérséklet megváltoztatásával, táplálkozást gátló vagy feromon-hatású (jelzést hordozó) vegyületek alkalmazásával vagy a fentiek kombinációival. Ferómon hatású vegyületek egyszerűen nyerhetők tápanyagban kimerült tenyészetekből, fonálféreggel vagy tiszta tenyészetből nyert Xenorhabdus-baktériummal fertőzött és elemésztett rovarok (lárvák, bábok, imágók) tetemeiből bármely, a preparatív biokémiában az amfipoláros, kis molekulatömegű vegyületek elválasztására alkalmazott eljárással, de alkalmazhatók a nyers preparátumok is. Az infektiv lárvákat a kívánt arányban tartalmazó tenyésztő egységeket felbontjuk, a hordozóközeget kiemeljük és 0,1-2,0% nemionos detergenst tartalmazó vízben rövid ideig áztatjuk. Detergensként bármilyen, biológiailag inaktiv kereskedelmi vegyület alkalmas, de előnyös a folyékony háztartási mosogatószerek használata. Az áztatott hordozóból bármilyen fizikai módszerrel (sajtolás, vákuum-, ill. nyomás alatti szűrés, centrifugálás, stb.) eltávolítjuk a fonálférgeket, majd a tópmaradványoktól (amelyek aránya a jól kivitelezett tenyészetekben minimális) többszöri ülepítéses vagy a fenti említett fizikai eljárások bármelyikével vagy azok kombinált alkalmazásával végzett mosással megtisztítjuk azokat. A nem kivónt fejlődési alakoktól szükség esetén anionos detergensekkel (előnyösen nátrium-dodecilszulfáttal), ismert módon végzett kezeléssel tisztítjuk meg az infektiv lárvák tömegét. A kinyert lárvatömeget ezután ismert módon, híg formaldehid-oldatban, hűtve tároljuk. A talajlakó vagy rejtett életű rovarkártevők elleni biológiai védekezésre az infektiv lárvákat tartalmazó szuszpenzió használható fel. Alkalmazása bármely ismert módon történhet: locsolással, permetezéssel, öntözéssel, árasztással, de szilárd hordozókkal (trágya, komposzt, forgács, zúzalék, tőzeg, földkeverék, stb.) történt elegyítés után az azok kijuttatására alkalmas agrotechnikai eljárásokkal is. Előnyösen alkalmazható ott, ahol nagy fajlagos értékű kultúrákat termesztenek és a talajfertótlenítö kémiai inszekticidek használata nem javasolt (pl. közvetlen fogyasztásra szánt zöldségek termesztése, üvegházak, csemete- és palántanevelók), de ott is, ahol a kártevő élőhelye a vegyszeres kezelés számára hozzáférhetetlen (a növénymaradványokban áttelelő lárvák, a nedves állapotban tárolt termékek kártevői, a növények belsejében élő kártevők). Az egyébként ismert alkalmazási módoktól eltérően - ahol mindig egy fonálféreg-fajt használnak fel védekezésre - mi úgy tapasztaltuk, hogy különböző fajok infektiv lárváinak keverékét használva lényegesen jobb rovarirtó hatás érhető el, ami különösen előnyös abban az esetben, ha a megvédeni kívánt kultúra talajában a kártevő rovarok (pl. di'ótférgek, vincellérbogár, filoxéra) egyedsűrűsége már eléri a gazdaságilag érezhető kártétel szintjét, s ezért egyedszámuk rövid idő alatt való csökkentése a védekezés célja. Eljárásunkat az alábbi példákon mutatjuk be. 1. példa Neoaplectana carpocapsae fonálférget kívánunk tenyészteni. Elkészítjük az alábbi összetételű sóoldatot: nátrium-klorid 7.5 g dikálium-hidrogén-foszfát 1.0 g ammonium-dihidrogén-foszfát 1.0 g desztillált víz 1000 ml Autoklávban sterilizáljuk 80 ml-ként 250 ml-es Erlenmeyer lombikban. A lehűlt oldathoz sterilen lombikonként 10 ml sertésszérumot és 10 g teljes tojásport adagolunk és jól összekeverjük. Beoltjuk a Xenorhabdus nematophilus tiszta tenyészetéből nyert baktérium-szuszpenzió 5 ml-ével (107 sejt/ml). Rázógépre helyezzük és 48 órán át 24 °C-on inkubáljuk. Az elófermentált tápoldatból 30-30 ml-t mérünk be az 1 literes tenyészedényekben elhelyezett, 1200 cm2 öszszetételű polisztirol hordozófelületre úgy, hogy az egyenletesen nedves legyen. Az egységeket 25 000 infektiv lárvával beoltjuk és 25 °C-os helyiségben 12 napig inkubáljuk. Ezután az edényeket felbontjuk, 0,2% detergenst tartalmazó csapvízzel kiöblítjük, a hordozót az Öblítővízbe áztatjuk. Ennek térfogata egységenként 500 ml. 90 perc elteltével a hordozót kiemeljük, szűrőcentrifugán egységenként 100 ml vízzel átmossuk, a mosófolyadékot egyesítjük. A fonálférgek a mosófolyadékból gyorsabban ülepednek le, mint a tápközeg maradékai, ezért a tisztítás üvegedényben jól ellenőrizhető. Háromszori átmosás után a fonálféreg-tömeget 0,1%-os formaldehid-oldattal vesszük fel és abban tároljuk. A hozam egységenként 1-1,5 millió infektiv lárva. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
