200194. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pertussis endotoxin eltávolítására
HU 200 hatunk, mint például kalcium-acetátot, kalcium-klo ridot, kalcium-nitrátot, stb. vagy oldhatatlan kalciumsókat, mint például kalcium-foszfátot stb. Ezek közül a kalcium-acetát és a kalcium-klorid előnyös. A foszfátion aránya a kalciumionhoz viszonyítva körülbelül 1,25-30ekvivalens, előnyösen 1,5-7,5 ekvivalens, és célszerű biztosítani, hogy körülbelül 0,01-0,1 milliekvivalens/ml, előnyösen 0,02-0,7 milliekvivalens/ml kalcium-foszfát-gél képződjön. A tipikus eljárás a következő: feltételezve, hogy a Bordetella pertussis I fázisú törzs fermentlevének felülúszóját ammónium-szulfáttal végzett frakcionált kicsapással kezeltük, a csapadékot 1 mól/1 nátriumklorid — 0,05 mól/I-es foszfát-pufferben oldjuk, annyi kalcium-acetátot adagolunk, hogy a végső koncentráció 0,1-1,0 tömeg/térfogat%, előnyösen 0,2- 0,6 tömeg/térfogat% és pH 6,5-0 érték legyen, az elegye! 20 perc és 2 óra közötti időtartam alatt hagyjuk fokozatosan 4 'C-ről szobahőmérsékletre melegedni, ez alatt kalcium-foszfát-gél képződik. Ezután a kialakult csapadékot ismert módon, például szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk. Ezzel a módszerrel az endotoxinnak körülbelül 90-99,9%-a szelektíven eltávolítható anélkül, hogy a védőfrakcióban észrevehető veszteség keletkezne. A fenti módon kapott fél-nyers terméket további zónacentrifugálásnak vetjük alá, előnyösen további ammónium-szulfiátos töményftés (firakcionált kicsapás) után. A zónacentrifugálás lehet szacharóz gradiens centrifugálás, kálium-tartarát sűrűség centrifugálás, cézium-klorid gradiens centrifugálás stb, ezek közül a szacharóz gradiens centrifugálás az előnyös. A szacharóz gradiens centrifugálás szokásos körülményei a következőt sűrűség gradiens: 0-30 tömeg%; R max: körülbelül 60.000-122.000 G; idő: körülbelül 10-14 óra. A fenti módon kapott, pertussis fertőzés ellenes frakciót tartalmazó folyadékot úgy toxinmentesítjük, hogy formaldehiddel, glutáraldehiddel, piruvaldehiddel kezeljük, majd a formaldehid, glutáraldehid, piruvaldehid stb. fölöslegét ismert módon, például dialízissel, centrifugálással vagy ultracentrifugálással stb. eltávolítjuk, így a pertussis toxoidot kapjuk. A toxinmentesítést előnyösen például az 57-50925. sz. közzétett japán szabadalmi leírásban ismertetett módon végezzük úgy, hogy a pertussis exotoxint tartalmazó folyadékhoz formaldehidet adunk körülbelül 0,1-0,6 térfogat% koncentrációban, olyan körülmények között, hogy bázisos aminosavak (például L-lizin, glicht stb.) lényegében ne legyenek jelen (azaz mennyiségük kevesebb, mint 10 mmól/1 legyen), a kapott elegyet 32-42 *C-on körülbelül 3-14 napig inkubáljuk, a flokulált toxoidot alkalmas módon (például körülbelül 10-50 kilociklusos ultrahangos kezeléssel) megtűrjük, és alkalmas vizes közegben (például 1/100-1/250 mól/1 foszfát-pufferes sóoldatban) szuszpendáljuk, így a toxoid folyadékot kapjuk. A találmány szerinti eljárással olyan pertussis toxoidot lehet előállítani, amelynek endotoxin tartalma 10 pg protein-nitrogénre vonatkoztatva nem több, mint 0,5 ng, előnyösen nem több, mint 0,1 ng, limulusz-lizátum teszt segítségével meghatározva. Más szóval az endotoxin eltávolításának aránya 99,9994%, előnyösen 99,9998% arányra javítható. 3 A találmány szerinti eljárással előállított pertussis toxoid csapadékos pertussis vakcina vagy csapadékos pertüssis-difitéria-tetanusz kombinált vakcina előállítására alkalmazható. Az 1. és 2. ábra a kalcium-foszfát-gél és kontroll minták szacharóz gradiens centrifugálási profilját mutatja. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül A következő példákban a referencia példákban ismertetett eljárásokban alkalmazott Bordetella pertussis Tohama I fázisú törzs tulajdonságait például az Infection and Immunity, &, 899 (1972) helyen ismertetik. A törzset a National Institute of Health, Tokió, Japán (NIHJ) intézetnél tartják fenn, és 1980. augusztus 13-a óta letétbe van helyezve az Institute of Fermentation, Osaka, Japán intézetnél IFO 14073 szám alatt 1. referencia példa bordet-Gengou tápközeget, amely burgonyából, peptonból, nátrium-kloridból, agárból és borjúvérből készük, beoltunk Bordetella pertussis Tohama I fázisú törzzsel (IFO 14073) és 2 napig 35 *C-on inkubáljuk. Ezután az áttetsző kerek kolóniákat Kaglutinin antitest reakcióval vizsgáljuk, s a pozitívan reagáló kolóniákat visszaoltjuk Bordet-Gengou tápközegbe oltótenyészet előállítása céljából. Az oltótenyészetet Cohen-Wheeler folyékony tápközegbe visszük át és 1 napig 35 *C-on inkubáljuk. A kapott baktérium szuszpenziót Stainer-Scholte folyékony tápközeghez adjuk 1 billió sejt/ml végkoncentrációban, és Rouxpalackban 5 napig 35 ‘C-on inkubáljuk. A fermentlevet összegyűjtjük, és a felülúszóhoz körülbelül 20 tö meg/térfogat% ammónium-szulfátot adunk. Alapos keverés után az elegyet 4 *C-on állni hagyjuk. 14 nap múlva az elegyet centrifugáljuk, a felülúszót eldobjuk, és az üledéket összegyűjtjük. Ezután az üledékhez az összegyűjtött folyadék tizedrészének megfelelő mennyiségű 1 mól/1 nátrium-klorid — 0,05 mól/1 foszfát-puffért adunk (pH= 8,0), és az elegyet alaposan elkeverjük, és 4 napig 4 *C-on állni hagyjuk. Ezután az elegyet újra centrifugáljuk, és a felülúszót (I extraktum) összegyűjtjük. Ez az első extraktum védőfrakcióban gazdag, rostos hemaglutinint (FHA) és pertussis toxint (PT), valamint endotoxint tartalmaz, azonban sejtmentes. Az első extraktum aliquot mintáihoz fokozatosan kalcium-acetátot adunk a következő végső koncentrációkig: 0,0,2,0,4,0,6,0,8 és 1,0 tömeg/térfogat%. Az elegyeket szobahőmérsékleten lí óra hosszat óvatosan keverjük, majd a kapott csapadékot szűrőpapíron leszűrjük. A lopott felül úszókat hemaglutinin (HA) ti térre PT-tartalomra és ET tartalomra vizsgáljuk. Az eredményeket az I. táblázat tartalmazza APT- tartalmat ELISA módszerrel, az ET-tartalmat limulus lizát módszerrel (Mallinckrodt kit) határozzuk meg, standardként E. coli endotoxint alkalmazva (Difco 055-B5). Az I. táblázatból látható, hogy az ET szelektíven eltávolítható úgy, hogy az oldathoz kalciumsót adunk fölösleges mennyiségű foszfátion jelenlétében, és a csapadékot eldobjuk. Ezenkívül 0/2-0,6 tömeg/térfogat% kalcium-acetát adago91ásával az endotoxinnak körülbelül 99%-a távolítható el anélkül, hogy a vé4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
