200194. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pertussis endotoxin eltávolítására

HU 200 A találmány tárgya eljárás pertussis endotoxin el­távolítására és endotoxinmentes pertassis toxoid elő­állítására. A pertussis a Bordetella pertussis által okozott cse­csemők és kisgyermekek körében súlyos lefolyású fertőző betegség. A betegség megelőzésére vakcinát alkalmaznak. Az olyan vakcinák azonban, amelyeket a teljes B. pertussis sejt felhasználásával készítenek, erős mel­lékhatásokat, például lázat okoznak. A mellékhatások kiküszöbölése céljából sejtmentes pertussis vakcinát (ACP vakcina) fejlesztettek ki, amely lényegében vé­ve endotoxin (ET) mentes. Az endotoxin felelős a lá­zért és egyéb mellékreakciókért. Az endotoxinmen­tes vakcinát úgy készítik, hogy elválasztják a fertőzé­sellenes frakciót (a továbbiakban a helyenként védőf­rakciónak nevezzük), úgymint a rostos hemaglutinint (FHA), a pertussis toxint (PT) és a rostokat Az ACP vakcina előállításának legfontosabb lépé­se az endotoxin elválasztása a fertőzésellenes frakci­ótól, amelyet rendszerint szacharóz-gradiens centri­­fugálással végeznek (57-50925. sz. közzétett japán szabadalmi leírás, amely megfelel a 47802. sz. köz­zétett európai szabadalmi leírásnak). Ezenkívül ismeretes, hogy a pirogén anyagok el­választására kalcium-foszfát-géles módszert alkal­maznak (34-2549. sz. közzétett japán szabadalmi le­írás). Ismeretes továbbá, hogy a hidroxil-apatit-gél, a kalcium-foszfát-gél stabilizált formája, alkalmas a rostos hemagluünin elválasztására a pertussis toxin­­tól, továbbá, hogy az endotoxin-mentes hemaglutinin elválasztható a pertussis toxintól hidroxil-apatit-gé­­len végzett kromatográfiával, majd affinítás-kroma­­tográfiával végzett tisztítással és a szacharóz-gradi­ens centrifugál ássál. (Japanese Journal of Bacterio­logy, 2S 0). 423, 1983). Az önmagánban végzett szacharóz gradiens cent­­rifugálás az endotoxinnak körülbelül 99,995%-a eltá­volítására alkalmas, de mivel a nyers, fertőzésellenes frakciót tartalmazó folyadék endotoxinban gazdag, nehéz elérni a védőfrakció teljes megtisztítását az en­dotoxin tói, és ennek megfelelően a védőfrakció kiho­zatala nem elég magas. Továbbá mivel a termelő tér­fogat kicsi és nagy a költség és időráfordítás, a mód­szer nem megfelelő kereskedelmi mennyiségű oltó­anyag előállítására. Másrészt a csupán kalcium-foszfát-géllel végzett kezelés az endotoxinnak körülbelül csak 90-99,9%­­a eltávob'tását biztosítja, így nem megfelelő gyakor­lati célokra. Laboratóriumi körülmények között a ros­tos hemaglutinin eléggé endotoxinmentesen elvá­lasztható és megtisztítható a pertussis toxintól törté­nő elválasztás során, ha hidroxil-apatit- oszlopkro­­matográfiával, affinitás kromatográfiával és szacha­róz-gradiens centrifugálással kombináljuk, a mód­szer azonban kereskedelmi mennyiségű oltóanyag­­termelésre nem alkalmazható. Kísérleteink során úgy találtuk, hogy a szacharóz gradiens centrifugálást megelőzően kalcium-foszfát­­gélt képzünk a folyadékban, a védőfrakció nagyon élesen elválasztható az endotoxintól, és emellett ja­vul a térfogatkihozatal és jelentősen javul az endoto­xin elválasztásának aránya az önmagában végzett szacharóz sűrűség centrifugáláshoz képest A találmány tárgya tehát egyrészt eljárás endoto-1 xin eltávolítására Bordetella pertussis I fázisú törzs endotoxinját és fertőzés elleni frakcióját tartalmazó folyadékból zónacentrifugálással oly módon, hogy a zónacentrifugálás előtt a folyadékban fokozatosan 4 *C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten, 6,5 és 9 közötti pH-értéken 0,01-1 milliekv/ml kalcium­­foszfát-gél csapadékot képezünk a foszfátionok ekvi­valenseinek 1,25-30-szoros fölöslegével a kalciumi­onok ekvivalenseire számítva, és a kapott csapadékot elkülönítjük, másrészt eljárás pertussis toxoid előál­lítására oly módon, hogy a fenti módon kapott fertő­zés elleni frakciót tartalmazó folyadékot toxinmente­­sítjük, és olyan pertussis toxoidot nyerünk, amelynek endotoxin tartalma 10 pg protein-nitrogénra vonat­koztatva kevesebb, mint 0,5 ng. A pertussis endotoxin eltávolítása a találmány sze­rinti módon lehetővé teszi, hogy a fertőzés ellenes frakciót biztosabban és élesebben válasszuk el az en­dotoxintól úgy, hogy a védőfrakció könnyebben és jobb kihozatallal nyerhető. Ezenkívül, mivel a zóna­centrifugálással nagy térfogatú kiinduló anyag dol­gozható fel, a pertussis toxoid kinyerése megdupláz­ható hatékony endotoxin eltávolítás mellett. így a ta­lálmány ipari szempontból is értékes. Azonkívül a találmány szerinti eljárással kapott pertussis toxoid endotoxin tartalma kevesebb, mint ti­­zedrésze a jelenleg forgalomban levő toxoidokénak, így a találmány szerinti eljárással előállított pertussis toxoid alkalmas olyan vakcinák előállítására, ame­lyeknek immunológiai hatékonysága azonos az is­mert vakcinákéval, toxieitása azonban kisebb. Az említett, Bordetella pertussis I fázisú törzs fer­tőzésellenes frakcióját és endotoxinját tartalmazó fo­lyadék például a B. pertussis I fázisú törzs tenyészté­sével kapott tenyészközeg vagy ennek koncentrátu­­ma lehet, a koncentrátum különösen előnyös. A Bor­detella pertussis I fázisú törzs tenyésztése a szokásos módon történhet így például a mikroorganizmust te­­nyészközegen (például Cohen-Wheeler vagy Stainer- Scholte közegen) körülbelül 35-37 *C-on, körülbelül 5-7 napig tenyésztjük. Az így kapott fermendé fel­­ülúszóját például szűréssel vagy centrifugálással összegyűjtjük. A felülúszőt közveüenül vagy betömé­­nyítés után alkalmazhatjuk a következő lépésben az endotoxin eltávolítására. A betöményítést az ismert kisózási módszerrel végezhetjük. Például eljárhatunk úgy, hogy 2-5 kg ammónium-szulfátot adagolunk, minden 101 fermendé felülúszójához, és a kapott csa­padékot például szűréssel vagy centrifugálással elvá­lasztjuk. A csapadékot alkalmas mennyiségű 1 mól/1 nátrium-klorid - 0,05 mól/1 foszfát-pufferben felold­juk, és az oldatot centrifugáljuk, vagy más módon el­választjuk a felülúszőt A találmány szerinti eljárással az endotoxin elvá­lasztását úgy végezzük, hogy a Bordetella pertussis I fázisú törzs fertőzés elleni frakcióját és endotoxinját tartalmazó folyadékban fölösleges mennyiségű fosz­fátion jelenlétében kalcium-foszfát-gél csapadékot képezünk, a kapott csakadékot elkülönítjük, és a fo­lyadékfázist zónaccntrifugálásnak vetjük alá. Ha a folyadékban foszfátion nincs jelen, akkor a folyadékhoz foszfátpuffert, például 1 mól/1 nátrium­­kloriddal kiegészített 0,05 mól/l-es foszfát-puffért adunk, majd kalciumionnal egészítjük ki. Kalciumi­­on-fonásként bármely oldható kalciumsót alkalmaz­2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2

Next

/
Thumbnails
Contents