200192. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GRF-analóg peptidek előállítására
HU 200192 B A jelen találmány tárgya eljárás olyan új peptidek előállítására, melyek emberekben és más állatokban befolyásolják az agyalapi mirigy működését Részletesebben a jelen találmány tárgya eljárás a növekedési hormonnak az agyalapi mirigyből való felszabadulását elősegítő peptidek előállítására. A fiziológusok régen felismerték, hogy a hipotalamusz szabályozza az adenohipofízís kiválasztási funkcióit olyképpen, hogy a hipotalamusz olyan speciális anyagokat termel, melyek stimulálják vagy gátolják az egyes agyalapi hormonok kiválasztását 1982-ben humán hasnyálmirigy (daganat) kibocsátó faktort (hp GRF) izoláltak humán hasnyálmirigy daganatok kivonatából, tisztították, jellemezték, szintetizálták és vizsgálták, és azt találták, hogy elősegíti a növekedési hormonnak (GH) az agyalapi mirigy által való kibocsátását A megfelelő patkány hipotalamuszos GH kibocsátó faktort, és a megfelelő sertés faktort is jellemezték és szintetizálták. Olyan szintetikus polipeptideket szintetizáltunk és vizsgáltunk, melyek hatására GH választódik ld te-, nyésztett agyalapi mirigy sejtekből, és amelyek legalább részlegesen ellenállnak a testben az enzimatikus lebomlásnak. Ezek a peptidek a következő kritériumok közül legalább egynek eleget tesznek: a) az 1-es helyen lévő maradékon vagy NaMe vagy Ca- Me helyettesítő van; b) a 17- és/vagy 23-as helyeken D-Leu van; és/vagy c) a 25-ös helyen D-Glu van. A peptidek több mint egy, vagy éppen az összes kritériumnak eleget tehetnek. Az 1-es helyen lévő maradék Tyr, Na-Me-Phe, Na-MeTyr vagy Ca-Me-pCl- Phe vagy His lehet A peptidek előnyösen a 27-es helyen Met helyett Nie szubsztituenst tartalmaznak. A találmány szerint előállított peptidek gyógyászati készítmények hatóanyagai lehetnek, melyek a peptideket gyógyászatiig vagy az állatorvoslásban elfogadható folyékony vagy szilárd hordozóban eloszlatva tartalmazzák. Ezeket a gyógyászati készítményeket használhatják mind a humán, mind az állatorvosi klinikai gyakorlatban gyógyászati célokra és diagnosztikai célokra is. Használhatók továbbá melegvérű állatok, ideértve a szárnyasokat, növekedésének meggyorsítására, a hidegvérű vízi állatok, például hal, angolna stb. tenyésztésében. A peptidek meghatározására használt nomenklatúra a Schroder és Lubke által meghatározott ["The Peptides", Academic Press (1965)], melyben szokásosan az N-teiminális aminocsoport a báloldalon található, a C-tcrminális karboxilcsoport a jobboldalon. A természetes aminosavak alatt a fehérjékben megszokott, természetesen előforduló aminosavakat értjük, úgymint Gly, Ala, Val, Leu, He, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, frp és His. Nie jelentése norleucin. Ha az aminosav izomer formában fordulhat elő, az aminosavnák az L- formája van jelen, hacsak külön másképpen nem jelezzük. A találmány tárgya eljárás az Rí - Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-R8-Ser-Tyr-Arg-Ri2-Rl3-Leu-Gly-Gln-Ri7- R18-Alá-Arg-Lys-Leu-R23-R24-R25-Ile-R27-R28-R (I) általános képletű új peptidek előállítására, ahol Rí jelentése His vagy NaMeTyr, Rs jelentése Ser, R12 jelentése Arg; R13 jelentése He; Rn jelentése Leu vagy D-Leu; Ris jelentése Tyr, R23 jelentése Leu vagy D-Leu; R24 jelentése His; R25 jelentése Glu 1 vagy D-Glu; R27 jelentése Nie; R28 jelentése Asn, és R jelentése Arg-NH2, azzal a feltétellel, hogy. vagy (i) Rt NaMeTyr, vagy (ii) R17 és/vagy R23D-Leu, vagy (iii) R25 D-Glu; vagy R1 jelentése NaMePhe, CaMe-pCl-Phe vagy NaMeTyr, Rs jelentése Asn; R12 jelentése Lys; R13 jelentése Val; Rn jelentése Leu; Ris jelentése Ser, R23 jelentése Leu; R24 jelentése Gin; R25 jelentése Asp; R27 jelentése Met; R28 jelentése Ser, R jelentése Arg- Gln-Gln-Gly-NEb. A találmány szerint úgy járunk el, hogy i) legalább egy, a peptidkémiában önmagában ismert védőcsoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyíiletről, melynek C-terminális vége adót esetben a peptidkémiában önmagában ismert gyantához kapcsolódik, a gyantát és/vagy a védőcsoportot vagy védőcsoportokat tehasítjuk. A kiindulási peptideket megfelelő módszerrel szintetizáljuk például kizárólagos szilárd-fázisú technikával részleges szilárd-fázisú technikával, fragment-kondenzációval vagy klasszikus, oldatban végzett kapcsolással. Az újabban kifejlesztett rekombináns DNS technikát is használhatjuk egy csak természetes aminosav-maradékókat tartalmazó analóg egy részének előállítására. A kizárólagos szilárd-fázisú szintézis technikájának leírását a „Solid-Phase Peptid Synthesis” című kézikönyvben találjuk [Stewart and Young, Freeman and Co., San Francisco (1969)], példákkal szemléltetve pedig Vale és munkatársainak 1978. augusztus 8-án közzétett 4.105.603. számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásában találjuk. A klasszikus oldatban végzett szintézist a ["Methoden der Organischen Chemie (Houben- Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch (editor) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, W. Ger.] című kötetben találjuk meg részletesen. A szintézis fragment-kondenzációs módszerére az 1976. augusztus 3-án közzétett 3.972.859. sorszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban találunk példát A többi, kivitelezhető szintézisre példát találunk az 1984. október 15-én közzétett3.842.067. sorszámú amerikai és az 1975. január 28-án közzétett 3.862.925. sorszámú amerikai szabadalmi leírásokban. Ezekben a szintézisekben közös lépés a különböző aminosav-egységek érzékeny oldallánc-csoportjainak megvédése megfelelő védőcsoportokkal, melyek megakadályozzák kémiai reakció lejátszódását az adott helyen mindaddig, míg a védőcsoportot el nem távolftják. Általában szokásos egy aminosavon vagy fragmenten az alfa-amino-csoport megvédése, miközben a molekula a karboxilcsoportjával reagál, majd az alfa-amino-védőcsoport szelektív eltávolítása, hogy lehetővé tegyék kémiai reakció lejátszódását az adott helyen. Ennek megfelelően általános, hogy a szintézis egy lépéseként olyan intermedier vegyületet állítunk elő, melyben az összes aminosavmaradék, a kívánt sorrendben található a peptidláncban, és a megfelelő maradékokhoz oldallánc-védőcsoportok kapcsolódnak. Ä találmány szerint alkalmazható intermedierek képlete például a következő: X'm vagy X>Ala-AspíX3)-Ala-De-Phe- ThríXl-Rs-ÍX4 vagy XO-SerÓO-TyríX2)-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
