200101. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán szövet plazminogén aktivátort tartalmazó stabilizált gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 200101 B 10 Puffer: 0,02 mól arginin 0,18 mól foszforsav 0,01 % Polysorbate 80 pH 6 Minden készítményből alikvot mintákat vettünk, melyeket aszeptikus körülmények között 5 vagy 10 ml-es ampullákba töltöttünk, liofilizáltunk, majd az ampullákat lezártuk. Az ampullákat különböző hőmérsékleteken tároltuk. Minden időpontban készítményenként két-két ampullából mintát vettünk, 5 és a t-PA aktivitást az S-2288 vizsgálattal határoztuk meg. Az eredményeket a 4. táblázatban tüntetjük fel. 4. táblázat A t-PA stabilitása liofilizált késziményekben t-PA Idő Maradék % (két mérés átlaga ± standard hiba) mg/ml* pH mo 5 °C 25 °C 30 °C 35 °C 40 °C 1,0 6,0 2,0 102,5±0,0 103,312,5 _ 102,613,0-2,0 6,0 2,0 111,3±0,7 111,1±0,1-114,612,2-5,0 6,0 2,0 112,OiO,3 112,710,6-112,311,4-1,0 6,0 3,5 98,2H,3 96,0H,7-97,7±0,01 * A t-PA koncentrációja a liofilizálás előtti oldatban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a t-PA stabil liofilizált formában. 5. példa Körülbelül 0,3-0,5 mg/ml t-PA-t tartalmazó oldatot 10 mmól nátrium-foszfátot (pH 7,5), 0,01% polysorbate 80-at és arginin -hidrokloridot különböző koncentrációkban tartalmazó oldattal szemben dializáltunk. Az oldhatatlan anyagot 2 perces, Eppendorf mikrocentrifugóval végzett centrifugálással eltávolitottuk. Az oldatban maradt t-PA mennyiséget S-2288 vizsgálattal határoztuk meg. Az eredményeket a 2. ábra mutatja. Már 50 mmól arginin is szignifikánsan növeli a t-PA oldhatóságét. A nagyobb arginin-koncentrációk esetében tapasztalt látszólag kisebb oldékonyság növekedés azzal magyarázható, hogy a kiindulási anyagban az eredeti t-PA koncentráció csak 0,3-0,5 mg/ml volt, és így soha nem sikerült elérni a határ oldékonyságot. 6. példa A t-PA-t 0,001 mól nátrium-szukcinát (pH 6) pufferrel szembeni dialízissel csaptuk ki. A kapott csapadékot centrifugálással izoláltuk, majd az anyag mért mennyiségét a kívánt puffer rendszer 1 ml-ében 20 órán ót 5 °C- on, keverés közben egyensúlyba hoztuk. A tanulmányozott puffer rendszereket úgy készítettük, hogy az arginint foszforsavval titrálva 6,0 pH-értékű argininium-foszfat rendszert hoztunk létre. A törzsoldatokat vízzel hígítva állítottuk elő a végső, 0,10- -0,20 mól arginint argininium ion formájában tartalmazó puffer oldatokat. A kívánt puffer rendszerrel végzett kiegyenlítést követően a kapott t-PA készítményeket centrifugáltuk, az 25 oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából, majd a felülúszókban az oldott t-PA-t a S-2288 módszerrel határoztuk meg. 30 Az eredményeket a 3. ábrán szemléltetjük. Ha a t-PA teljesen oldható az eredetileg hozzáadott t-PA koncentrációnál, az oldható t-PA koncentrációjának a hozzáadott koncentrációval azonosnak kell lennie. Megfordítva, 35 ha a t-PA nem teljesen oldható az eredetileg hozzáadott koncentrációban, a 3. ábra azt mutatja, hogy 6,0 pH-jú 100 mmólos arginin-foszfát pufferben a t-PA körülbelül 2 mg/ml koncentrációig oldható, és nagyobb arginin- 40 -foszfát koncentráció esetében az oldhatóság jelentősen megnő. Különösen, 6,0 pH-jú, 200 mmólos arginin-foszfát puffernél a t-PA 54 mg/ml koncentrációban is teljesen oldható, és a határoldékonyság nyilvánvalóan ennél is 45 lényegesen magasabb. 7. példa Az alábbi argininium-foszfát rendszert preliofilizált oldatként állítottuk elő. Preliofilizált oldat , mg/ml t-PA 2,5 55 L-arginin 87,1 foszforsav 26,8 Polysorbate 80 0,1 pH 7,2 Steril szűrést követően körülbelül 20 ml- 50 es alikvot mintákat 50 ml-es ampullákba töltöttünk. A liofilizálást a következőképpen végeztük: a) Az ampullákat liofilizáló berendezésbe helyeztük, és -50 °C-on (polc hőmérsék-7
