200101. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán szövet plazminogén aktivátort tartalmazó stabilizált gyógyszerkészítmények előállítására
5 HU 200101 B 6 á. Ábra ismertetés Az 1. ábra a t-PA különböző készítményekben mutatott stabilitását szemlélteti. A 2. ébrén az arginin-koncentréciónak a t-PA oldhatóságára mutatott hatása szerepel. A 3. ábra a t-PA oldhatósági határait mutatja be az argininium foszfát pufferek koncentrációi esetében, 6 pH-értéken, 4 °C-on. B. Liofilizálás A készítmény liofilizálésát vagy fagyasztva szárítását a szakember számára jól ismert eljárások és berendezések felhasználásával végezzük. Jellegzetesen a készítményt először nyilvánvaló eutektikus vagy összeesési hőmérséklete alá fagyasztjuk. Ezután vákuumot alkalmazunk, és a liofilizáló polcokat melegítjük, hogy a jeget szublimélással eltávolítsuk, a polc hőmérsékletet és a kamra nyomást úgy választva meg, hogy a fagyott massza hőmérséklete az eutektikus vagy öszszeesési hőmérséklet alatt maradjon mindaddig, míg lényegében a jég teljes mennyiségét eltávolitottuk. Ezt az .elsődleges szárítási" fázist követően a polcok hőmérséklete tovább emelhető (kamra nyomás egyidejű megváltoztatásával vagy anélkül), és a fagyasztva szántással kapott pogácsa maradék nedvességtartalmát elhajtjuk. C. S-2288 vizsgálat Az S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitro-anilid • 2HC1) szintetikus polipeptid szubsztrátot t-PA-val hidrolizáljuk, és igy szives p-nitro-anilint és tripeptidet állítunk elő. A szubsztrát és a termék (p-nitro-anilin) közötti maximális differenciális abszorpció 5 405 nm-nél mutatkozik. A p-nitro-anilin keletkezését spektrofotometriásán követjük, a 405 nm-en észlelt abszorpciót az idő függvényében vizsgálva. A kapott abszorpció - idő görbe meredeksége arányos a t-PA 10 aktivitással. A vizsgálatot 37 ± 0,2 °C-on végezzük. A vizsgálat során 20 - 100 mikroliter t-PA mintát adtunk 1,2 ml reakcióelegyhez, amely 0,33 mmól S-2288-at, 0,067 mól Tris- 15 -puffert (pH 7,4) és 0,07 mól nátrium-kloridot tartalmazott, és amelyet 37 °C-on 10 percig inkubáltunk. Az abszorpcióban észlelt változást 1 percig követtük, és az aktivitást a 405 nm-en észlelt abszorpcióból a keletke- 20 zó, a gyártó által standardizált egyenlet felhasználásával: Aktivitás (IE, nemzetközi egység) = _ OD x 793,65 (higitási faktor) inkubálási idő x minta térfogat D. Példák 30 1. példa Tisztított t-PA-t 0,2 mg/ml végső koncentrációig hígítottuk, majd egy alikvot mintát az 1. táblázatban felsorolt pufferekkel 35 szemben dializáltunk. 0,01 X Polysorbate 80-at Dialízis koncentráció tartalmazó dialízis puffer NaCl arginin (HC1) 1. 0,01 mól nátrium-foszfát pH 6--2. 0,01 mól nátrium-foszfát pH 6 0,12 mól 0,2 mól 3. 0,01 mól nátrium-foszfát pH 6-0,2 mól 4. 0,01 mól nátrium-acetát pH 5--5. 0,01 mól nátrium-acetát pH 5 0,12 mól 0,2 mól 6. 0,01 mól nártium-acetát pH 5-0,2 mól Dialízis után a mintákat centrifugáltuk, és a felülúszót 1 ml-es alikvotokban liofilizáltuk. A lofilizált mintákat vízzel visszahigitottuk, és a t-PA aktivitást az S-2288 teszttel vizsgáltuk. Minden visszahígított mintát 37 °C hőmérsékleten tartottunk és különböző időpontokban vizsgáltunk. A kísérlet eredményeit az 1. ábrán mutatjuk be. Mint látható, az arginint nem tartalmazó rendszerek nem gátolják meg a t-PA aktivitás csökkenését az idővel. Azokban a mintákban, amelyek 0,2 mól arginint vagy 0,2 mól arginint és fiziológiás mennyiségű kloridot tartalmaznak, 4 napos 37 °C-on végzett inkubálás után a kezdeti t-PA aktivitás csaknem teljes mértékben fennmarad. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy 0,2 mól arginin - nátrium-kloriddal együtt vagy anélkül - szignifikánsan stabilizálja a t-PA-t. 2. példa A t-PA stabilitálást az arginin-koncentráció függvényében úgy határoztuk meg, hogy mértük a t-PA aktivitás csökkenésének mértékét különböző hőmérsékleteken. 5
