200093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellemes gyógyászati készítmények előállítására
15 HU 200093 B 16 gonistát adtunk. 2 perc és 5 perc után a vezikula szuszpenzióból vett mintákat Sartorius membrán filterre (0,65 m pórusméret) vittük, és vákuum alatt hideg, 0,16 M KC1- -oldattal kétszer mostuk. A filter a vezikulákat visszatartja, igy a filteren maradó 45Ca radioaktivitásból a kalciumfelvétel kiszámítható. A 4SCa izotóp aktivitásának mérését folyadék szcintillációs módszerrel, Beckman LS-7500 műszerrel végeztük [részletesen lásd Sarkadi és munkatársai (1980)]. 3. A kísérletekben használt kalmodulin preparátum a T30 275/3857/81 számú magyar nyilvánosságrahozatali irat szerint készült. 4. A vizsgálatok értékelésénél a kalciumfelvétel sebességét a lineáris tartományban vizsgáltuk [Sarkadi és munkatársai (1980)], és nmol Ca x mg IQV fehérje'1 x percében adtuk meg a kalcium transzport sebességét. Kísérleti eredmények CDM hatása IOV-k kalmodulin-függó kalcium felvételére: Az IOV-k gyors kalciumfelvételt mutatnak, amely kalmodulin hatására jelentősen fokozódik. 60 nmol/1 kalmodulin közel maximális transzport aktivitást eredményez. CDM hozzáadása a kalmodulin hatását koncentráció-függő módon gátolja, míg a kalmodulin-független (bazális) kalcium transzport sebességet alig befolyásolja. A kalmodulin hatást fél-maximálisan gátló CDM koncentráció (Ki kalmod.) az adott rendszerben 5,5 ± i 0,3 umol/l-nek adódott. A bazális kalcium transzportot felére csökkentő CDM koncentráció 200 umol/l-nél nagyobbnak adódott. A CDM gátló hatása függ az alkalmazott kalmodulin koncentrációtól. A gátlás jelentősen lecsökken magasabb kalmodulin koncentrációk jelenlétében. CDM hatása proteolitikusan aktivált kalcium pumpára Az IOV-k aktív kalciumfelvétele részleges proteolitikus emésztéssel aktiválható, és egyben kalmodulin-érzéketlenné válik [Sarkadi és munkatársai, Ann. N. Y. Acad. Sei., 402, 329-348. (1982)]. Eredmény A kalmodulin aktivált kalcium pumpát a CDM 5,5 ± 0,3 umól/l-es Ki értékkel gátolta, mig a proteolitikusan aktivált enzim esetében a Ki értéke magasabb mint 50 *imol/l, A CDM és ismert kalmodulin-antagonista vegyületek hatásának összehasonlítása A CDM hatását vinblasztinnal [Vinblasztin. H2SO4 -mol.tőmeg: 911,4 (SERVA)], klórpromazinnal [(Klórpromazin.HCl -mol.tömeg: 335 (SIGMA)], trifluoperazinnal [(Trifluope- razin.2HCl -mol.tömeg: 336,45 (SIGMA)] és kalmidazoliummal [(R-24571) -mol.tömeg: 850 (SIGMA)] hasonlítottuk össze. A CDM az ismert leghatékonyabb kalmodulin antagonisták közé tartozik. A CDM hatása a vőrösvérsejt-membrán tfa, K-ATP-áz aktivitására Minthogy a CDM hatékonyan gátolja a vőrösvérsejt-membrán vezikulák kalmodulin-függó kalcium transzportját megvizsgáltuk, hogy ez a hatás mennyire szelektív, illetve mennyire jár együtt más ATP-t használó transzport folyamatok, igy a Na,K-ATP-áz aktivitásának gátlásával. Módszer Az IOV-k Na-K-ATP-áz aktivitását anorganikus foszfor felszabadulása révén mértük. [Sarkadi és munkatársai, Biochim. Biophys. Ac ta, 464, 93-107. (1977)]. Eredmény A CDM Mg-függő ATP-áz aktivitást nem, a Na,K-függő ATP-ázt pedig csak magas koncentrációkban és kismértékben gátolta. A 200 uM CDM koncentrációnál észlelt mintegy 30X-os gátlás éles ellentétben áll a kalmodulin-függŐ transzport aktivitás esetében talált 5,5 ± 0,3 jumol/l-os Ki értékkel. CDM hatása trombociták és limtociták térfogat szabályozására Trombociták és limfociták hipoozmotikus médiumba helyezve kezdeti gyors duzzadást, majd regulációs térfogatcsökkenést mutatnak [Grinstein, S., Am. J. Physiol., 246, C204-C215 (1984)]. E térfogatszabályozás alapja kalcium-függő K-csatornák és független Cl csatornák megnyílása, majd az ezt kővető KC1 és víz kiáramlása. A folyamat mind limfociták, mind trombociták [Sarkadi és munkatársai, Am. J. Physiol., 248, C480-C487 (1985)] esetében hatékonyan gátolható kalmodulin antagoniste vegyületekkel. Módszer Az emberi trombociták és limfociták térfogatszabályozását az elektronikus térfogat-mérés módszerét alkalmazó Laborscale (Medicor) műszerrel vizsgáltuk [Sarkadi és munkatársai (1985)]. Eredmény A trombociták hipoozmotikus médiumban gyors duzzadást mutatnak, majd a kontrollsejtek 10 percen belül közel teljes mérték5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
