199897. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz enzim előállítására
1 HU 199897 B 2 A találmány tárgya eljárás nagyti&zlaságú dezacetoxi-cefalosporin-C-szintetáz előállítására. A cefalosporin-C biosztintézisében a dezacetoxi-cefalosporin-C-szintetáz (expandáz) végzi a penicillin-N gyűrű tágítását dezacetoxi-cefalosporin-C-l (DAOC) eredményezve. Ez utóbbit a D AOC - hidroxiláz dezacet il-cefalosporin-C-vé alakítja (DAC). A dezacetoxi-cefalosporin-C-szintetáz enzim részleges tisztítását Cephalosporium acremonium-ból és Streptomyces clavuligerus-ból végezték. Kupka, J. és munkatársai (FEMS Microbiol. Lett., 16: 1 -6 (1983)|, Scheidegger, A. és munkatársai (J. Antibiot., 37: 522 — 531 (1984)] az enzimet C. acremonium-ból tisztították, míg Jensen, S. E. és munkatársai [Antimicro. Agents Chemother., 24: 307-312 (1983)], valamint Jensen, S. E. és munkatársai [J. Antibiot., 38: 263 — 265 (1985)| a részleges tisztítást S. clavuligerus-ból végezték. A részleges tisztított enzimpreparátumokkal végzett vizsgálatok alapján feltételezik, hogy a gyűrűtágítást (dezacetoxi-cefalosporin-C képzését) és a hidroxilálást (dezacetil-cefalosporin-C képzését) a prokarióta S. clavuligerus-nál két különböző enzim végzi, míg az eukarióla C. acremoniumnál egy, expandáz és hidroxiláz aktivitással rendelkező, bifunkcionális enzim. A találmány eljárása szerint tisztított enzim expandáz és hidroxiláz aktivitással rendelkező bifunkcionális enzim. Az ábrákon az alábbiakat mutatjuk be: 1A ábra: az enzimet tartalmazó nyers extraktum gyenge anioncserélő gyantán kapott kromatogramja, 1B ábra: a gyenge anioncserélő gyantáról kapott, az enzimet tartalmazó eluátum gélszűréssel nyert kromatogramja, IC ábra: a gélszűrésnél nyert, az enzimet tartalmazó eluens hidroxiapatiton kapott kromatogramja, 1D ábra: a hidroxiapatiton végzett kromatográfia enzimet tartalmazó eluátumának FPL kromatogramja (FPLC: gyors protein folyadékkromatográfia), 2A ábra: A penicillin-N átalakítása dezacetoxi-cefalosporin-C-vé az expandáz aktivitással és a dezacetoxi-cefalosporin-C átalakítása dezacetil-cefalosporin-C-vé a hidroxiláz aktivitással, 2B ábra: a dezacetoxi-cefalosporin-C átalakítása dezacetil-cefalosporin-C-vé, 3A ábra: az enzim expandáz aktivitásának HPLC kromatogramja, 3B ábra: az enzim hidroxiláz aktivitásának HPLC kromatogramja. A találmány szerint a Cephalosporin arcremoniumból nyert enzimet gyenge anioncserélő Sántán kromatografálva, majd gélszűréssel és droxiapatiton végzett kromatografálással tisztítjuk, majd további tisztítást végezhetünk erős anioncserélő gyantán történő kromatografálássál. Az enzimet 95% körüli tisztasággal nyerjük ki, és ez az enzim mutatja a nyeri enzimextraktum dczacctoxi-cefalosporin-C-l és dezacetil-cefalosporin-C-t termelő bifunkcionális aktivitását. A kromatográfiás tisztítás során a dezacetoxi•cefalosporin-C-szintelázt stabilizálja a glicerinből vagy szaccharózból, 1-3 szénatomszámú, egyértékű alkoholból, például etil-alkoholból, szulfhidrilcsoportot tartalmazó redukálószerből, például ditiotreitből és aszkorbátból (GEDA) álló közeg. A találmány szerint a tisztított dezacetoxi-cefalosporin-C-szintetázt olyan többlépéses kromatográfiás folyamattal nyerjük, ahol a körülményeket úgy alakítjuk ki, hogy az enzim stabil marad. Az így kapott tisztított enzim egy monomer protein, melynek gépiszűréssel megállapított molekulatömege 43000-nek adódott. A nátriumdodecil-szulfát/poliakrilamid gélelektroforézissel (SDP - PAGE) megállapított minimális molekulatömege: 41000. A tisztított dezacetoxi-cefalosporin-C-szintetáz izoeleklromos pontja: 6,0 ± 0,5. A tisztított enzim fajlagos aktivitása: 0,2- -0,8 egység/mg. Aminosavösszetételét az I. táblázatban mutatjuk be. 1. táblázat A dezacetoxi-cefalosporin C-szintetáz aminosavösszetétele Aminosav 41000 Daltonra eső savmaradék száma Asx (Asp + Asn) 37 Thr 24 Ser 26 Glx (Glu + Gln) 35 Pro 21 Gly 31 Alá 34 Val 32 Cys 6 Met 5 Ile 8 Leu 27 Tyr 10 Phe 20 His 6 Lys 17 Arg 29 ïrp 3 Összesen 371 Amint azt az 5. ábra reakciófolyamatán bemu tatjuk, a tisztított expandáz/hidroxiláz enzim a penicillin-N-et dezacetoxi-cefalosporin-C-vé, ez utóbbit dezacetil-cefalosporin-C-vé alakítja. A tisztított enzim egyaránt vas(II)-iont, a-ketoglutársavat és oxigént igényel a penicillin-N- nek dezacetoxi-cefalosporin-C-vé, és a dezacctoxi-cefalosporin-C-nek dezacetil-cefalosporin- C-vé váló átalakításához viszonyított aránya 0,15 ± 0,04. A tisztított enzim mindkét funkcióját (expandáz és hidroxiláz) fokozza a reakciókeverékben jelenlevő ditiotreit, aszkorbát és az ATP. Az enzim expandáz és hidroxiláz aktivitását reverzibilisen reaktiválja a ditiotreit és az aszkorbát. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
