199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 ténő alkalmazásra. 4. Oldatok, emulziók, kenőcsök, paszták, krémek, borogató vizek, púder kUlsó, lokális alkalmazásra. 5. A különböző gátlóanyagok kombinációi, amelyeknek a hatásspektruma egymást kölcsönösen kiegészíti. Az új hatóanyagok koncentrációi a megfelelő gyógyszerformában a 0,01 -100 mg/ml oldat határok között mozognak, előnyösen 0,1 — 10 mg/ml között. Az új hatóanyagokat a szokásos módon alkalmazhatjuk, különösen a következő felhasználási módok előnyösek: a) parenterális: intravénás, intramusculáris, szubkután, intraartikuláris, intratumorális, b) lokális: például intranasalis c) orális. Dózistartományként a jelen találmány szerint előállított hatóanyagokra a következőket adhatjuk meg: 0. 1-20 mg hatóanyag/testsúlykilogramm, előnyösen 1-10 mg hatóanyag/testsúlykilogramm, az adagolás mindenekelőtt a kezelendő betegségtől és a felhasználási módtól függ. A jelen találmány szerint előállított anyagok emberen és állaton használhatók. A találmány szerinti eljárást a következő példákon szemléltetjük. 1. példa Dez-Lys-15-aprotinin—pentametilészter a) Aprotinin’-hexametilészter 160 mg (~ 25 /xmól) aprotinin’-t 45 ml, hidrogén-kloridra 0,1 mólos metanolban oldunk és ezt az oldatot szobahőmérsékleten (20 °C) tartjuk. Egy esetlegesen fellépő kiválást további metanol hozzáadásával feloldunk és az észteresítést HPLC-vel és CM Sephadex C-25-ön végzett kromatográfiával ellenőrizzük. Kb. 150 óra után az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot 15 ml metanollal leöntjük, amelyet azonnal ledesztillálunk. Az oldási-bcpárlási művelet többszöri megismétlése után a maradékot 20 ml vízben oldjuk. Liofilizáláskor 150 mg aprotinin'-hexametilésztert kapunk, színtelen anyagként. Relatív eiektroforetikus mozgékonyság: 1,61 (pH 5- puffer); relatív retenciós idő a HPLC-n 2,04 (aprotinin - re 0,59). Az anyagot 10 ml 0,05 mólos 4,5 pH-jú kálium-foszfát-pufferban oldjuk és ezt az oldószerként használt pufferrel egyensúlyba hozott CM-Sepharose CL-4 B Fast Flow-val töltött oszlopra (2,4 - 45 cm) visszük. Az oszlopot a felvivőpufferból és a 0,8 mólos, nátrium-kloridot tartalmazó start puffe rból álló oldószergradienssel fejlesztjük ki. Az aprotinin'-hexametilészter 0,6—0,7 mólos nátrium-klorid koncentrációnál eluálódik az oszlopról. Az anyagot tartalmazó eluátumokat összegyűjtjük, Amicon UM-02-es membránon ultraszűréssel sótalanítjuk és 0,1 mólos ecetsavval utánamossuk. A. maradék liofilizálásakor 125 mg színtelen anyagot kapunk. b) Di-ciszteinil- 14.38-aprotinin^-hexametilészter 104 mg aprotinin"-hexametilésztert —16 ftmól)12 ml 0,1 mólos, 5,8 pH-jú oxigénmentes foszfátpufferben oldunk. Ehhez az oldathoz 154 mg ditiotreitolt (mmól) adunk. 6,5 órás állás után a reakcióoldatot nitrogénatmoszférában ecetsavval pH = 3-ra állítjuk. A ditiotreitol elválasztása céljából az elegyet Sephadex G — 25-ön szűrjük (oszlopméret: 2,5x100 cm), és a proteintartalmú szűrletet liofilizáljuk. 95 mg színtelen anyagot kapunk. c) Di-ciszteinil-14,38-aprotinin--pentametilészter 90 mg (~ 14 /jmól) az lb példa szerint előállított anyagot 10 ml, 6,75 pH-jú, 0,1 mólos foszfátpufferban oldunk, és 25 mg a triptofánrészen formilezett tripszinnel 2 ml, 8 mólos, 8,0 pH-jú karbamidoldattal készült oldatából 1 ml-t adunk hozzá. A reakcióoldatot 14 órán át 22 °C-on tartjuk. Azután sósavat adunk hozzá, amíg a pH 2 értéket el nem éri és az oldatot egy Sephadex G — 50 oszlopon (2,5x120 cm) szűrjük, eluálószerként 2,0 pH-jú 0,1 mólos ecetsav-sósav oldatot használunk, hogy az enzimet és az aprotinin’ származékot elválasztjuk. Az aprotinin* származékot tartalmazó frakciók liofilizálásával 75 mg színtelen anyagot kapunk. d) Aprotinin—pentametilészter és dez-lizin-15-aprotinin—pentametilészter 70 mg az le. példa szerint nyert anyag 10 ml, 6,25 pH-jú, 0,1 mólos foszfátpufferes oldatát 22 °C-on lassú áramban levegőt buborékoltatunk át, amíg az Ellman-próba eredménye negatív nem lesz. Azután egy karboxipeptidáz B szuszpenzió 50 pl-ét adjuk a reakcióoldathoz, és az elegyet 1 órán át 22 °C-on tartjuk. 0,75 ml ecetsav hozzáadása után a reakcióoldatot, a karboxipeptidáz B és a lehasadt lizin elválasztása céljából, egy Sephadex G —50 oszlopon (2,5x125 cm) szűrjük, eluálószerként 0,1 mólos ecetsavat használunk. A dez-lizin-15-aprotinin*-pentametilésztert tartalmazó frakciók liofilizálásával 50 mg színtelen anyagot kapunk. 2. példa Dez-lizin-15-aprotinin— pentametilészter a) Aprotinin—pentametilészter 100 mg, az la. példa szerint előállított aprotinin"-hexametilésztert 48 ml, 0,1 mólos, 3,5 pH-jú nátrium-acetát-pufferben oldunk. 50 ml dioxán hozzáadása után egy 30 mg tripszin(TPCK-kezelt)/ml 10^ normál sósav oldat 2 ml-ét adjuk hozzá és az oldatot az átalakulás befejeződéséig (HPLÇ ellenőrzés), mintegy 2 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Azután 1 ml ecetsavat adunk a reakcióoldathoz és vákuumban 10 ml-re bepárpljuk. A pH-t sósavval 2,0-ra állítjuk, majd az oldatot, 2,0 pH-jú, 0,1 mólos ecetsav-sósav oldat eluálószerrel, egy Sephadex Gj50 oszlopon (2x120 cm) szűrjük. Az aprotinin*-pentametil-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
