199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 Oxidálószerként alkalmazható továbbá H2Ü2 vagy K3IFe(CN)6]; A 15 helyzetű lizin lehasítása aprotinin -pentamctilészterből könnyen végbemegy karboxipeptidázok segítségével, mint például karboxipeptidáz Y-nal, különösen könnyen azonban karboxipeptidáz B-vel, pufferolt oldatokban, 3 és 7,5 közötti, előnyösen 4,0 és 7,0 közötti pH értékeken. A karboxipeptidázokat és a dez-Lys15- aprolinin’-pentametilésztert a reakcióoldat megsavanyítása után, önmagában ismert módon, molekulaszűrő oszlopokon történő szűréssel, 1 — 7, előnyösen 2-5 pH értékű puffereknek, különösen azonban híg ecetsavnak eluálószerként történő alkalmazásával, elválasztjuk. A dez-Lysl5-aprotinin’-pentametilészter az aprotinin-homológok kiindulási anyaga, amelyet a megfelelő szűrlet liofilizálásakor színtelen anyagként kapunk. A 15 helyzetű lizinrészt helyettesítő új aminosav bevezetése a dez-Lys15-aprotinin*-pentametilészter és a megfelelő aminosav karbodiimides kondenzációjával történik vizes oldatokban, amelyek azonban szerves oldószereket, mint például alkoholokat, dimetil-formamidot vagy dimetil-szulfoxidot és/vagy sókat is tartalmazhatnak. A kondenzációra különösen vízoldható karbodiimidek alkalmasak, mint például: N-ciklobexil-N’-2-(4-morfolinil)-etil-karbodiimid-metil-toluol-4-szulfonát, N-terc-butil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid, N-ciklohexil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid, N-izo-propil-N’-(3- -dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid, vagy előnyösen N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid, valamint kettő vagy több felsorolt karbodiimid keverékei. A karbodiimides reakciókat -10 °C és + 35 °C között végezzük, különösen 0 °C és 25 °C között. Eközben a reakcióoldatban a reakció alatt, híg ásványi sav hozzáadásával, 4,0 és 7,5 közötti pH értéket biztosítunk. Az aprotinin-homológok szintézisében alkalmazott aminosav-alkilészterben az észter alkilcsoportja egyenesláncú, elágazóláncú vagy gyűrűs is lehet és legfeljebb hat szénatomot tartalmazhat. A lioészter és fenilészter is használható, de előnyösen mégis a megfelelő aminosavak metilészterét alkalmazzuk. A kondenzációknál a dez-lizin-15-aprotinin*-pentametilészterre mólonként mintegy 10- —1000 mól aminosavésztert és mintegy 8 — 800 mól karbodiimidet veszünk. A karbodiimideknek a 14 helyzetű félcisztinrész szabad karboxilcsoportjára történő addíciója révén, melléktermékként, váltakozó mennyiségű acilkarbamid képződik (dez-Lys15-Cys -urcido-aprotinin"-pentamctilészter). Ezenkívül a karbodiimideknek a tirozinrészek fenolos hidroxilcsoportjaira történő addíciójával O-aril-izokarbamid-származékok keletkeznek. Ezeket a vegyületeket az aminosav-15-aprotinin*-hexametilészterekkel együtt a reakcióelegy gélszűrésekor kapjuk és, amint azt később leírjuk, a keverékből elválasztjuk, illetve felszabadítjuk. Az aminosav-15-aprotinin’-hexametilészterek inhibitorokként aktivak. 50-95%-os kitermeléssel képződnek. Az enzimatikusan irányított intramolekuláris amidszintézist a találmány szerinti eljárásban azzal segítjük elő, hogy a 15 helyzetű aminosav karboxilcsoportját észteresítéssel aktiváljuk, és ez nem disszociáltan van jelen. Az acilenzimnek a reszintézist megelőző képződését átészterezéssel érjük el, amely energeiikailag kedvezőbb, és tökéletesebben és mintegy 103-szor gyorsabban végbemegy, mint a 15 helyzetben szabad karboxilcsoportot tartalmazó homológok kondenzációja. A szintézis szempontjából fontos továbbá, hogy a 15 helyzetű aminosavon képződő enziminhibitor-komplex miatt, egy bizonyos tetraéderes deformáció következtében, megteremtődnek az intramolekuláris peptidkötés újraszintézisének sztérikus feltételei. A 15 helyzetbe újonnan bevezetett aminosav és a 16 helyzetű alanin közötti peptidkötés enzimatikus kialakítására azok a proteázok alkalmasak, amelyek a szubsztrát zsebe a 15 helyzetű -aminosavrész oldalláncának megfelel. Az L-metionint tartalmazó homológ esetében ez például vagy a kimotripszin, vagy a katepszin G; L-leucint és L-norleucint, valamint L-norvalint tartalmazó homológok esetében a kimotripszin, katepszin G vagy granulocitákból vagy hasnyálmirigyből nyert elasztáz; L-valint és L-u-aminovajsavat tartalmazó homológok esetében granulocitaelasztáz és meglepő módon tripszin is. L-alanint tartalmazó homológok esetén hasonló módon történik a kovalens amidkötés kialakítása hasnyálmirigyelasztázzal vagy tripszinnel. A tripszin alkalmas olyan aprotinin-homológok szintézisére is, amely a 15 helyzetben L-arginint vagy meglepő módon, glicint tartalmaznak. A peptidkötés enzimkatalizálta szintézisének a peplidkémiai eljárással szemben az az előnye, hogy itermolekuláris kondenzációval nem képződnek nem kívánatos melléktermékek. Vagy oldott enzimekkel, vagy előnyösen hordozóhoz kötött enzimekkel, heterogén fázisban hajtható végre az eljárás. Az enzimatikus kondenzáció számára megfelelő közegek a 2 és 10 közötti pH értékű pufferoldatok. Előnyösen 5 és 8,5 pH értékű foszfát-, trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán-, borát-puffert vagy etanolamin-puffert alkalmazunk. A sztöchiometrikus mennyiségű proteinázzal végrehajtott, 1:1 komplexek képződésével, majd azt követően a komplexeknek enzimre és aprotinin-homológra történő gyors disszociációjával végbemenő, kinetikusán meghatározott szintézisek helyett, a szintézist termodinamikusan kontrollálva, katalitikus mennyiségű enzimmel is elvégezhetjük. Az így szintetizált aprotinin-homológok kitermeléseit vízzel elegyedő szerves oldószerek, mint például glicerin, 1,4-butándiol és dimetil-formamid, hozzáadásával megnövelhetjük. A 15 és 16 helyzetű aminosavak közötti kötés létrehozásakor, a lúgos oldatban, a még meglévő észtercso5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
