199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 9. példa 1 L-Valin-15-aprotinin a) Meg - lel a 3. példa a) lépésének. b) L-Valin-15-aprotinin-pentametilészter 12.5 mg granulociténelasztáz 25 ml 0,05 mói/l-es 5.5 pH-jú nátrium-acetát-pufferrel készült oldatához, amely nátrium-kloridra nézve 0,1 mól/l-es, 23 mg, a 3. példa a) lépésében nyert L-valin-15- aprotinin'-hexametilésztert adunk. Ezután a reakcióelegy pH-ját szilárd trisz-(hidroxi-metil)amino-metán adagolásával 7,5-re állítjuk be. 50 mg magnézium-klorid-hexahidrát adagolása után a reakcióelegy pH-ját ismét 7,5-re állítjuk be, és az oldatot 12 óra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk. Ennyi idő után az enzim teljesen inaktív lesz. A reakcióelegy térfogatát Amicon UM —2 szűrőn ultraszűrvc kb. 2 ml-re csökkentjük, és a koncentrátumot Sephadex G —50 oszlopon — 1x48 cm -, amelyet 0,1 mól/l-es, 7,5 pH-jú borát-pufferrel kiegyenlítettünk, eluálószerként a kiegyenlítőoldatot használva szűrjük. 2,8 ml-es frakciókat fogunk fel. A 12 — 22. közötti frakciók (az eluátum 31—62 ml-e) tartalmazzák az elasztáz-Val-15-aprotinin-hexametilészter-komplexet, ezeket egyesítjük. Az egyesített frakciók térfogatát egy amicon UM - 2 szűrőn kb. 2 ml-re csökkentjük, és pH-ját 1 n sósavval 1,8-ra állítjuk be. A kapott oldatot Sephadex G — 50 oszlopon (1x48 cm) 0,1 mól/l-es, 1,8 pH-jú ecetsav-sósav eluálószerrel szűrjük, az eluátumok felfogására használt csövek mindegyikébe előre 100 mg nátrium-acetátot mérünk be. A 12 — 16. frakciók (az eluátum 31 — 45 ml-e) tartalmazzák a nemdiszszociált elasztáz-inhibitor-komplexet, a 17 — 24. frakciók pedig (az eluátum 45-67 ml-e) a granulociténelasztázt, és a 25-33. frakciók (az eluátum 67 — 92,5 ml-e) a Val-15-aprotinin-pentametilésztert. A 12-24. frakciókat egyesítjük, és ultraszűréssel kb. 15 ml-re történt betöményítés után újra Val- 15-aprotinin-pentametilészter szintéziséhez használjuk. A 25 — 33. frakciókat Spectrapor® dializálócső segítségével vízzel szemben sótalanítjuk. A maradék fagyasztva szárításával 2,8 mg Val-15-aprotinin-pentametilésztert kapunk, melynek relatív visszatartási ideje HPLC-ben 1,87, relatív elektroforetikus mozgékonysága 1,75. Az aminosav-összetétel megfelel az elméletinek. 41 lépéses szekvenciameghatározás eredménye igazolja a Val-15-aprotinin-pentametilészter jelenlétét. c) Valin-15-aprotinin 2 mg Val-15-aprotinin-pentametilésztert 60 óra hosszat 1 ml 0,1 mól/l-es, 10,5 pH-jú borátpufferben tartunk. A borátpuffer imidazolra nézve 0,2 mól/l-es. Ezután a sókat Spektrapor® dializálócsövön vízzel szemben végzett kimerítő dialízissel eltávolítjuk, és a maradékot fagyasztva szárítjuk. így 1,6 mg színtelen anyagot kapunk, melynek relatív elektroforetikus mozgékonysága 0,90, és a relatív visszatartási ideje HPLC-ben 0,87. Az aminosav-összetétel az 1. táblázatban található. 10. példa L-izoleucin-15-aprotinin a) L-Izoleucin-15 aprotinin--hexametilészter 300 mg (46 fjmól) dez-lizin- 15-aprotinin*•pentametilésztert és 800 mg (4,41 mmól) L-izoleucin-metilésztert feloldunk 20 ml jégecetben. 10 perc múlva az elegyhez hozzáadunk 280 mg (1,41 mmól) N-etil-N’-3-dimetil-amino-propilkarbodiimid-hidrokloridot, majd 120 percig szobahőmérsékleten tartjuk, és ezután újra, ugyanezt a mennyiséget hozzáadjuk. A reakció folyamán az oldat pH-ját 0,01 n sósav adagolásával 4,7 és 5,0 közötti értéken tartjuk. A reakciót 4 °C-on további 12 óra hosszat hagyjuk folyni, majd a reakció elegyet 70 ml vízzel elegyítjük. Az elegyet ezután CM-Sephadex-Fast-Flow-oszlopra visszük, és 1 liter 0,05 mól/l-es, 5,5-ös pH-jú, 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó foszfát-pufferből álló gradienssel fejlesztjük ki, és 10 ml-es frakciókat fogunk fel. A 129 — 140. frakciókat Amicon UM - 2-membrán segítségével ultraszűréssel sótalanítjuk. A termék fagyasztva szárítása után 95 mg (35%) színtelen anyagot kapunk, amely granulocita-elasztázzal szemben jó inhibitor aktivitást mutat. HPLC-n relatív retenciós ideje: 1,74 (az aprotininre vonatkoztatva). b) L-lzoleucin-15-aprotinin-pentametilészter 25 mg granulocita-elasztáz 25 ml, 5,5-os pH-jú, nátrium-kloridra nézve 0,1 mól/l-es, 0,05 mól/l-es nátrium-acetát-pufferrel készült oldatához 30 mg 3a. példa szerinti L-izoleucin-15-aprotinin'-hexametil-észtert adunk, majd a pH-t szilárd Tris-(hidroxi-metil)-amino-metánnal 7,5- re állítjuk. A reakcióelegyhez ezután hozzáadunk 50 mg magnézium-klorid-hexahidrátot, és a pH-t újra 7,5-re állítjuk, majd az oldatot 12 óra hosszat szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az enzim ennyi idő után csaknem teljesen inaktív lesz. A reakcióelegy térfogatát Amicon UM-2 szűrőn ultraszűréssel 2 ml-re csökkentjük, és a koncentrátumot Sephadex G - 50 "fine", 1x48 cm méretű, 0,1 mól/l-es 7,5 pH-jú borát-pufferrel kiegyensúlyozott oszlopon szűrjük, eluálószerként a kiegyensúlyozott oszlopot használjuk. 2,8 ml-es frakciókat fogunk fel. A 12-22. frakciók (31 ml-62 ml) tartalmazzák az elasztáz-Ile-15- aprotinin-pentametilészter-komplexet, ezeket egyesítjük, és Amicon UM-2 szűrőn ultraszűréssel 2 ml-re betöményítjük. A visszamaradt anyag pH-ját 1 n sósavval 1,8-ra állítjuk be. Ezt az oldatot Sephadex G — 50 "medium”, 1x48 cm méretű oszlopon szűrjük, eluálószerként 0,1 mól/l-es, 1,7 pH-jú ecetsav-sósav elegyet használunk, és az eluátum felfogására használt kémcsövek mindegyikébe 100 mg nátrium-acetátot mérünk be. A 12—24. frakció (az eluátum 31—67 ml-e) tartalmazta a granulocita-elasztázt, és a 25 — 33. frakció (az eluátum 67 — 92,5 ml-e) az Ile-15-aprotinin-pentametilésztert. A 12-24. frakciókat egyesítjük, és térfogatát ultraszűréssel 15 ml-re csökkentjük, majd újra felhasználjuk Ile-aprotinin-pentametilészter szintéziséhez. A 25-33. frakciókat Spectacor® dializálócsőben vízzel szemben végzett kimerítő dialízissel sóta-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
