199880. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15-ös helyzetben levő lizin helyén más aminosavakat tartalmazó aprotinin homológok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199880 B 2 A találmány tárgya eljárás új aprotinin homológok előállítására, amelyekben ez a lizinrész glicinre, L-yalinra, L-leucinra, L-izoleucinra, L-argininre, L-norleucinra vagy L-norvalinra van kicserélve. A találmány tárgya továbbá eljárás a homológok előállításakor fellépő köztitermékek előállítására, és a homológok gyógyszerként való alkalmazása. Az aprotinin egy szarvasmarha szervekből nyert ismeri kallikrein-tripszin-inhibitor. A szerkezete ugyancsak ismert (I képlet). A peptidlánc reaktív centrumában, a 15-helyzelben, egy lizinrész van, amely meghatározó az inhibitor specificitása szempontjából. H. Jering és H. Tscheche, Europ. J. Biochem. 61, 443 /1976/ közleményéből ismert, hogy a kémiai és enzimatikus reakciók sorozatával előállított dez-Lys15-aprotinin*-ba a hiányzó lizin helyett enzimek segítségével bázikus és aromás aminosavak beépíthetők, míg más aminosavak beépítése a 15-helyzetbe ezen úton nem volt lehetséges. Aprotinin’-nak a továbbiakban az olyan aprotinint nevezzük, amelyben a 15-helyzetű lizin és a 16-helyzetű alanin közötti peptidkötés el van hidrolizálva. A fenti enzimatikus mutációnak nevezett eljárás, amellyel a fenil-alanint, triptofánt és arginint tartalmazó aprotinin-homoiógokat előállították, csak a fenil-alanint és triptofánt tartalmazó homológok esetében eredményez egy-láncú proteineket. Az arginin15-származékot az arginin 39 — alanin 40 kötés hasításával és az arginin 39 elvesztésével mint két láncú proteint nyerik. A kémiai mutációnak nevezett és dez-Lys15- -aprotinin*-nek a glicin, L-alanin, L-valin, L-leucin, L-metionin és L-arginin aminosavak észtereivel vízoldható karbodiimidek segítségével végrehajtott kondenzációjával olyan aprotinin - származékok nyerhetők, amelyek a 15-helyzetben részben az illető aminosav-észtereket tartalmazzák, amelyekben azonban ez az aminosavészter egyidejűleg az aszparaginsavrészek (3- és 50- -helyzet), valamint a glutaminsavrészek (7- és 49-helyzet) oldatláncaiban lévő, és a terminális alanin (58-helyzet) perifériális karboxilcsoportjaival részben, vagy teljesen, amidkötések képződése közben kondenzációs reakcióba lép [H. R. Wenzel und H. Tschesche, Angw. Chem. 93, 292 /1981/). Ezenkívül az átalakítás során a karbodiimideknek a karboxilcsoportokhoz történő kapcsolódása révén nemkívánatos acilkarbamidok képződnek. Eszerint az irodalom szerint a 15- helyzetű aminosavészter és a 16-helyzetű alanin közötti peptidkötés enzimatikus újraszintetizálása után nem kapnak tiszta aprotinin-homológokat, hanem ezen homológok származékainak keverékeit. Olyan tiszta aprotinin-homológok, amelyek a 15-helyzetben más aminosavakat tartalmaznak, mint a fenil-alanin és a triptofán, ennélfogva nem ismertek. A találmány tárgya eljárás ilyen homológok előállítására. Ezek a homológok csak abban különböznek az aprolinintól, hogy 15-belyzelbcn lizin helyett glicint, L-valint, L-uciot, L-izolcucint, L-norvalint vagy L-norleucint tartalmaznak. Ezeket a homológokat megfelelő kémiai és enzimatikus reakciólépések sorozatával jó kitermeléssel elő lehet állítani. Ehhez először az Eur. J. Biochem. 61, 443- -452 (1976) helyen H. Jaring és H. Tschesche állal ismertetett módon előállítjuk a lizin15 és alanin16 között hasított peptidkötést tartalmazó módosított aprotinint ( = aprotinin*). Az aprotinin* előállítására a Cys1 -Cys38 diszulfidhíd előzetes redukciója nélkül is végrehajtható plazmin vagy Dermasterias imbricataból nyert tengericsillagtripszin enzimmel. Azután a molekula hat szabad karboxilcsoportját ismert módon, metanolos sósav segítségével aprotinin’-hexametilészter képződése közben észteresítjük (R. Avineri-Goldmann; J. Snir; G. Blauer; M. Rigbi, Arch. Biochem. Biophys. 121,107 — 116,71967/). Az észteresítést egy ismert eljárás (J. Bello. Biochim. Biophys. Acta 20, 426/1956/) analógiájára trialkiloxoniumfluoroboráttal is végezhetjük. Aprotinin’-nek metanol-tionilkloridos reakciója is alkalmas továbbá az aprotinin'-hexanietilészter előállítására. Az észteresítéshez metanol helyett más alkoholok is megfelelőek, amelyeknek kicsi a proteindenaturáló hatása, mint például az etanol, valamint alifás alkoholok hat szénatomosig, amelyeknek adott esetben például halogénatom szubsztituenseik lehetnek. Előnyösen mégis az aprotinin* hexametilészterét használjuk a további átalakításokhoz. Szükség esetén a nyers anyagban tökéletlen átalakulás vagy mellékreakció következtében keletkező kísérő anyagokat önmagában ismert módon kationcserélőn végzett ioncseréiőkromatográfiával távolíthatjuk el. (Manual der. Fa. Pharmacia: Ion Eschange Chromatography). Erre a karboxil- vagy szulfocsoportokat tartalmazó kationcserélők a megfelelőek, mint a CM-Cellulóz, CM-Sephadex, CM-Sepharose és az SP-Sephadex. Az ioncserekromatográfiát 3 és 7 közötti pH-n, előnyösen 4 és 6 közötti pH-n, megfelelő pufferoldatokkal végezzük. Ilyen pufferoldatok például a foszfát-, acetát-, szukcinát- vagy citrátoldatok, amelyeknek a sótartalmát az eluálás alatt folyamatosan vagy szakaszosan emeljük. Előnyösen nátrium-kloridot használunk a sógradiens létrehozására. Aprotinin*-bői kiindulva példaként a valin-15-aprotinin szintézisét ábrázoltuk sematikusan az 1. ábrán. A bemutatott szintézisvázlaton a reakciólépések ábrázolása az aprotininmolekulának az aktív centrumot (15. helyzet) tartalmazó részére korlátozódik. A perifériális karboxilcsoportokon végbemenő reakciókat (észterezések és elszappanosítások) az ábrán nem vesszük figyelembe. Az anyagokat a következőképpen nevezzük: 1) Aprotinin] 2) Aprotinin’-hexametilészter 3) Di-ciszteinil-14,38-aprotinin’-hexametilészter 4) Di-ciszteinil-14,38-aprotinin’-pentametilészter 5) Aprotinin’-pentametilészter 6) Dez-lizin-15-aprotinin*-pentametilészter, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
