199877. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ANF-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 199877 B 2 ek és amelyek 1 — 4 nitrogénatomot tartalmazhatnak a gyűrűben, mint például az imidazolinok, a pirazolidok és az 1,2,4-triazolidok (például speciális előnyösen alkalmazható heterociklusos amidok az N,N-karbonil-diimidazol, és az N,N-karbonil-di-l,2,4-triazol); (6) alkoxilezett acetilének (például etoxi-acetilén); (7) olyan reagensek, amelyek az aminosav karboxilcsoportjával vegyes anhidridet képeznek (például az etil-klór-formiát és az izobutil-klór-formiát), vagy a kapcsolandó aminosav szimmetrikus anhidridje (például Boc-Ala-O-Ala-Boc); (8) nitrogéntartalmú heterociklusos vegyületek, amelyek a gyűrű nitrogénatomján hidroxilcsoportot tartalmaznak (például N-hidroxi-ftálimid, N-hidroxi-szukcinimid és 1-idroxi-benzotriazol). Más aktiváló reagenseket és alkalmazásukat írta le Kapoor (J. Phar. Sei, 59, 1 — 27 /197Û/) közleményében. A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazott aminosav kapcsolási eljárás a kapcsolandó aminosav szimmetrikus anhidridjének kapcsoló ágensként való alkalmazása. A Gin, Asn és Arg esetében az előnyös kapcsolási eljárás során a védett aminosavat vagy származékait vagy izomerjeit 1:1 arányú N,N-diciklohexil-karbodiimiddel és 1-hidroxi-benzotriazollal reagáltatjuk N,N-dimetil-formamidban a gyanta vagy a gyantához kötött aminosav vagy peptid jelenlétében. Az egyéb aminosavak és távtartó csoportok esetében alkalmazott előnyös kapcsolási eljárás során a védett aminosavat, vagy származékát vagy izomerjét N,N-diciklohexil-karbodiimiddel reagáltatjuk diklórmetánban és a szimmetrikus anhidridet állítjuk elő. Ezután a szimmetrikus anhidridet a gyantát vagy a gyantához kötött aminosavat vagy pepiidet tartalmazó szilárd fázisú reaktorba visszük és a kapcsolást dimetilformamidban, diklórmetánban vagy dimetilformamid-diklórmetán 1:1 arányú elegyében hajtjuk végre. A kapcsolási reakció megtörténtét minden egyes szintézis lépésben ninhidrid tesztvizsgálattal ellenőrizzük Kaiser és munkatársai (Analyt. Biochem. 34, 595 /1970/) közleményében leírt eljárása szerint. Amennyiben nem teljes kapcsolás zajlott le a kapcsolási eljárást megismételjük. Amennyiben a kapcsolás még mindig nem teljes, a védőcsoport nélküli amint blokkoló csoporttal látjuk el, hogy megakadályozzuk további szintézisben való részvételét. Ilyen speciális blokkoló reagensek a szakember előtt ismertek. Alkalmazható blokkoló védőcsoport reagensek például az ecetsavanhidrid és az acetil-imidazol, amint ezt Stewart és munkatársai ('Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, III/1984/, Chapter 2, p.73) közleményükben leírták. Miután a kívánt aminosav szekvenciát előállítottuk a peptidet a gyantáról lehasítjuk. Ezt a műveletet a szakirodalomban ismert eljárásokkal végezhetjük, például a gyantához kötő észter vagy amid kötést hidrolizáljuk. A benzhidril-amin gyantáról a peptidet előnyösen dimetil-szulfid, p-krezol, tiokrezol vagy anizol vízmentes hidrogénfluoridban készült oldatával hasíthatjuk le. A hasítási reakciót előnyösen körülbelül 0 °C körülbelül szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. A reakciót előnyösen körülbelül 5 perc - körülbelül 5 óra időtartamig végezzük. Mint ez a szilárd fázisú peptid szintézissel kapcsolatosan, a szakirodalomban ismert, számos kapcsolt aminosav oldalláncon funkciós csoportokat tartalmaz, amelyek a peptid előállítása során védőcsoport bevezetését igénylik. Az ilyen oldallánc funkciós csoportok megfelelő védőcsoportjainak kiválasztása és alkalmazása a szakember előtt ismert és függ a védőcsoporttal ellátandó aminosav, valamint a pepiidben egyébként jelenlevő aminosavak jelenlevő védőcsoportjainak minőségétől. Az ilyen oldallánc funkciós csoport védőcsoport kiválasztása döntő befolyású, ugyanis ez a peptid szintézis védőcsoport eltávolítást reakcióiban és kapcsolási reakcióiban stabil kell hogy maradjon. Például amennyiben alfa-aminocsoport védőcsoportként Boc csoportot alkalmazunk, az oldallánc védőcsoportok az alábbiak lehetnek: a Lys és Arg esetében például az oldallánc aminocsoportját p-toluol-szulfonil-csoporttal védhetjük; az oldalláncban tiolcsoportot tartalmazó aminosavak, mint például cisztein, homocisztein, penicillinamin és hasonlók vagy származékaik esetében az oldallánc szujfid-csoportjának védésére p-metil-benzil-csoport, acetamido-metil-csoport, benzilcsoport (Bzl), vagy t-butil-szulfonil-csoport alkalmazhatója; a karboxilcsoportot oldalláncban tartalmazó aminosavak mint például Asp, Glu esetében az oldalláncban karboxilcsoport védésére benzilcsoport (Bzl) vagy ciklohexil-észter-csoport alkalmazható; az oldalláncban hidroxilcsoportot tartalmazó aminosavak, mint például Ser és Thr oldalláncbani hidroxilcsoportjának védésére benziléter (Bzl) származék alkalmazható; és az oldalláncban hidroxilcsoportot tartalmazó aminosav például a Tyr esetében az oldallánc hidroxilcsoportjának védésére 2-bróm-karbobenzoxi-csoport (2Br-Z) alkalmazható. Ezeket az oldallánc funkciós csoport védőcsoportokat a szakirodalomban ismert szokásosan alkalmazott eljárásokkal vezetjük be és távolítjuk el a molekulából. Az oldallánc védőcsoportokat előnyösen anizol vízmentes hidrogénfluoridban (1:10) készült oldatának alkalmazásával távolítjuk el. Az oldallánc védőcsoportok eltávolítását jellemzően akkor végezzük, amikor a peptidlánc szintézise befejeződött, de más eljárás szerint ezek a védőcsoportok bármely más időpontban is eltávolítbatók. Ezeket a védőcsoportokat előnyösen akkor távolítjuk el, amikor a peptidet a gyantáról lehasítjuk. Miután a peptidet a gyantáról eltávolítottuk a (49) általános képletű hidat a megfelelő oldalláncokat a szakirodalomban ismert standard eljárásokkal való kovalens kötéssel történő kapcsolásával hozzuk létre. Például az (50) diszulfid híd a megfelelő szulfidok oxidációjával állíthatók elő, Stewart és munkatársai ('Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, 111., /1984/, p. 95) közleményében leírt eljárása szerint. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
