199860. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gangliozid-származékok és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199860 B 2 A gangliozid-származékok hatása a neuron membrán (Na+, K+) ATPáz enzimére Anyagok és módszerek a) Patkányagy nyers mitochondrium frakciójának előállítása (P2 frakció) A P2 frakció előállításánál Morgan és munkatársai eljárását követtük [Biochem. Biophys. Acta, 241, 37 (1971)]. (A különféle műveleteket 0 és 4 °C közötti hőmérsékleten végeztük el, az xg érték az átlagos centrifugális erő.) Kifejlett, hím, 150-175 mg testtömegű Sprague Dawley patkányok (szállító: Charles River) fejét levágtuk, az agy velőt azonnal eltávolítottuk, és jéghideg izotóniás oldattal mostuk. A kisagy kimetszése után az agyakat 4 térfogatrész homogenizáló oldat alkalmazásával homogenizáltuk motorral meghajtott üveg és teflon homogenizáló készülékben, 12 felfelé és lefelé mozgást végezve (névleges sugárirányú játék 0,25 mm; 800 fordulat/perc). A homogenizáló oldat 0,32 M szacharóz-oldat, amely 1 mM káliumfoszfát puffert és 0,1 nM etilén-diamin-tetraecetsav- dinátriumsót tartalmaz, pH=7,27. A homogenizált anyagot négy rétegű finom gézen történő szűrés után 15 percig centrifugáltuk 1000 fordulat/perc fordulatszámon. A kapott szemcsét ugyanilyen kezdeti térfogatú homogenizáló oldattal mostuk, és a fentiek szerint centrifugáltuk. Az egyesített felülúszó folyadékokat 25 percig centrifugáltuk 17500 fordulat/perc fordulatszámon, és a szemcsét négyszer mostuk 9-9 térfogatrész homogenizáló oldattal, majd mindig 25 percig centrifugáltuk 17500/perc fordulatszámon. (Ezeket a centrifugálási körülményeket alkalmaztuk annak érdekében, hogy a frakció maximális mértékben feldúsuljon az idegvégződésekben.) A végső szemcse (elnevezése P2 frakció) tartalmazza fő alkotórészeként az egész mitochondriumot és idegvégződéseket. Ezt a szemcsét alkalmas menynyiségű homogenizáló oldatban szuszpendáltuk üveg és teflon homogenizáló berendezés segítségével, és azonnal felhasználtuk a vizsgálathoz. Minden felhasználás előtt friss P2 frakciókat készítettünk, hogy elkerüljük az anyag tartósításából adódó eltéréseket. A P2 frakciók gangliozid-tartalma 33,9 æ 2,8 (S.D) nanomól kötött szialinsav per mg fehérje. b) Az ATPáz enzim aktiválása Az ATPáz enzim aktiválása spektrofotometriásán mértük Wallick és munkatársai szerint [J. Pharm. Exptl. Therap., 189, 434 (1974)]. A reakcióelegy összetétele az alábbi, hacsak másképpen nem adjuk meg: 50 mM szacharóz, 0,2 mM etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsó (pH=7,4 értékre beállítva), 100 mM nátriumklorid, 5 mM magnéziumklorid, 10 mM káliumklorid, 2 mM foszfo(enol)piruvát- monokáliumsó (pH=7,4 énékre beállítva), 3 mM ATP, 50 mM trisz- hidroklorid (pH=7,4), 0,33 mM NADH, 30 g/ml piruvát-kináz (PK) és 10 g/ml laktát-dehidrogenáz (LDH) 3 ml végső térfogatban; a végső pH- érték: 7,2. A reakciót azzal indítottuk be, hogy 50-75 mg mennyiségű (fehérjeként megadva) P2 frakciókat adtunk hozzá. A (Na+, K+)-ATPáz aktivitását a teljes ATPáz aktivitása és a függő ATPáz Mg2+ aktivitás közötti különbség adja, ahol a mérést 3xlO"5 M Ouabain jelenlétében végezzük. Az egyes vizsgálatok elvégzéséhez 3-5 percre volt szükség. Az ATPáz aktivitás értékét nemzetközi egységben. (l.U.) fejezzük ki, amelynek jelentése mikromól hidrolizált ATP/mg fehérje/perc. A gangliozid-származékok (50 nM) aktivitását úgy állapítottuk meg, hogy inkubálást végeztünk a neuron membránokkal 37 ”C-on 2 órán át. A ATPáz aktivitás összehasonlító vizsgálatának eredményeit a 2. táblázat tartalmazza. 2. táblázat Gangliozidok és származékaik hatása a neuron membránban lévő (Na+, K+) ATPáz enzimre Termék Koncentráció (Na+, K ) ATPáz aktivitásának növekedése, % Kontroll 50 100 Gangliozidkeverék (GA) 50 142 (lásd a 2. példát) Gmi 50 133 GA metilésztere 50 128 GA amidja 50 139 Gmi metilésztere 50 132 Gmi amidja 50 128 Megjegyzendő, hogy a találmány szerint előállított gangliozid- származékok időben nyújtottabb hatással rendelkeznek, mint a gangliozidok, ezért mint,/etárd” gyógyászati készítmények hatóanyagai használhatók. Ezt a jelenséget például az alábbi kísérletekkel igazoljuk, a gangliozid-észterek felszívódásának kinetikája kapcsán. A gangliozid-származékok eloszlása a vérben in vivo 1. Radioaktív izotóppal jelzett termékek előállítása Radioaktív izotóppal jelzett gangliozidot a Suzuki és munkatársai által leírt módon [J. Lipid Res., 13, 687-690 (1972)] állítunk elő, Ghidoni és munkatársai módosítása szerint [Ital. J. Biochem., 23, 320-328 (1974)]. Ennek a radioaktív izotóppal jelzett ganglíozidnak az észterezésével állítjuk elő az etil-és az izopropilésztert. Mind a gangliozid, mind az észterek fajlagos radioaktivitását megmérjük. 2. Az állatok kezelése A Charles River (Calco) cégtől beszerzett, 20-25 g tömegű svájci egereket a termékek 10 mC radioaktivitású mennyiségével kezeltük intravénásán. 2, 4, 8, 12 illetve 16 óra elteltével az állatok fejét levágtuk, a vérüket pedig heparinnal kezelt lombikokban gyűjtöttük össze. Packard TRICARB szcintillátor segítségével határoztuk meg a vérminták radioaktivitását, és vékony- rétegkromatográfiás vizsgálattal viszonyítottuk a 3H izotóppal jelzett gangliozidéhoz és az észterekéhez. 3. Eredmények A kapott eredmények az 1. ábrán láthatók. A tríciummal jelzett gangliozid intravénás beadása után a ki5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 34
