199847. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid vegyületek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, valamint inszekticid, akaricid vagy nematocid készítmények
1 HU 199847 B 2 A Streptomyces mikroorganizmus tenyésztését általában 20 és 50 'C közötti hőmérsékleten, előnyösen 25 és 40 ‘C közötti hőmérsékleten levegőztetés és keverés, például rázatás közben végezzük. Eljárhatunk úgy, hogy a tápközeget kismennyiségű mikroorganizmus spőraszuszpenzióval oltjuk be, de eljáihatunk úgy is - a lag-növekedés elkerülése érdekében -, hogy a mikroorganizmus vegetatív inokulumát készítjük úgy, hogy a tápközeg kisrészét spórával oltjuk be, és a kapott vegetatív inokulummal oltjuk be a fermentációs közeget, vagy előnyösebben egy vagy több előtenyésztési lépésben szaporítjuk a mikroorganizmust, és ezt visszük a fő fermentációs tápközegbe. A fermentációt általában 5,5 és 8,5 közötti pH-nál végezzük. A fermentáció ideje általában 2-10 nap, például 5 nap. Az (V) általános képletű vegyületeket az így kapott fermentléből szokásos elválasztási módszerekkel választjuk el. Különféle elválasztási módszerek alkalmazhatók, például adszorpció-elució, kicsapás, frakcionált kristályosítás és oldószeres extrakció, amelyek különböző módon kombinálhatok. Az oldószeres extrakciót és kromatografálást találtuk a vegyületek elválasztására a legalkalmasabbnak. Az (V) általános képletű vegyületek előállításának egy előnyös módszerét mutatjuk be az első preparátumban. Az olyan (I) általános képletű vegyületeket, ahol -OR3 jelentése hidroxilcsoport, előállíthatjuk úgy is, hogy az olyan (I) általános képletű vegyületekből, ahol -OR3 jelentése védett hidroxil-csoport, a védőcsoportokat eltávolítjuk. így például az acilcsoport, például acetilcsoport eltávolítható bázisos hidrolízissel, például nátriumvagy kálium-hidroxid alkalmazásával vizes alkoholban, vagy savas hidrolízissel, például koncentrált kénsav alkalmazásával metanolban. Az acetálcsoportok, például a tetrahidropiranilcsoport eltávolítható például úgy, hogy savas hidrolízist végzünk (pl. ecetsavval vagy trifluor-ecetsavval vagy hígított ásványi savval). A szililcsoportok eltávolíthatók például fluorídionokkal (pl. tetraalkil-ammónium-fluorid, például tetra-n-butil-ammónium- fluorid segítségével), hidrogén-fluoriddal vizes acetonitrilben vagy savval, például p-toluol-szulfonsavval (pl. metanolban). Az aril-metil-csoportok eltávolíthatók egy Lewis-savval végzett kezeléssel (pl. bór-trifluorid-éter) egy tiol (pl. etán-tiol) jelenlétében, alkalmas oldószerben, például diklór-metánban, például szobahőmérsékleten. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal és preparátumokkal mutatjuk be közelebbről, a korlátozás szándéka nélkül. A következő preparátumokban és példákban a vegyületeket az ismert, A, B, C és D faktorok származékaiként nevezzük el. Az A faktor olyan (VI) általános képletű vegyület, ahol R1 jelentése izopropilcsoport és R3 jelentése hidrogénatom; a B faktor olyan (VI) általános képletű vegyület, ahol R1 jelentése metilcsoport és R3 jelentése metilcsoport; a C faktor olyan (VI) általános képletű vegyület, ahol Rl jelentése metilcsoport és R3 jelentése hidrogénatom; a D faktor olyan (VI) általános képletű vegyület, ahol R1 jelentése etilcsoport és R3 jelentése hidrogénatom. /. preparátum: 5-keto-A-faktor Streptomyces thermoarchaensis NCDB 12015 törzzsel ferde agait oltunk be, és 28 "C-on 10 napig inkubáljuk. A ferde agar összetétele a következő: Élesztő kivonat (Oxoid L21 ) 0,5 Maláta kivonat (Oxoid L39) 30,0 Mikológiái pepton (Oxoid L40) 5,0 Agár No. 3 (Oxoid L13) 15,0 Desztillált víz (pH 5,4) 1 literre Az érett tenyészeteket azután 6 ml 10 %-os glicerínoldattal fedjük be, és steril eszközökkel lekaparjuk a spórákat és a micéliumokat. A kapott spóraszuszpenziőból 0,4 ml-es aliquotokat steril polipropiléncsövecskékbe helyezünk, amelyeket hővel lezárunk, és folyékony nitrogénben tárolunk, amíg szükséges. 2 db 250 ml-es Erlenmeyer- lombikot, amelyek 50 ml oltóközeget tartalmaznak, beoltunk 0,2 ml spóraszuszpenzióval. Az oltóközeg összetétele a következő: gU D-glükóz 15,0 Glicerin 15,0 Szójapepton 15,0 Nátrium-klorid 3,0 Kalcium-karbonát 1,0 Desztillált víz 1 literre (A közeg pH-ja beállítás előtt 6,7, amelyet vizes nátrium- hidroxiddal 7-re állítunk be autoklávozás előtt A közeg pH-ja autoklávozás után 7,3). A lombikot 3 napig 28 °C-on inkubáljuk egy 50 mm amplitúdóval mozgó, 250 fordulat/perc sebességű rázógépen. A két lombik tartalmát egy 70 literes, 40 liter ugyanolyan tápközeget tartalmazó fermentor beoltására használjuk. A fermentorban levő tápközeghez a habzás meggátlására 0,06 térfogat% polipropilén 2000-t adagolunk. A fermentációt 28 °C-on végezzük, keverés és levegőztetés közben, a telítési érték 30 %-ánál nagyobb oldott oxigénszint biztosítása érdekében. 24 óra hosszat végzett fermentáció után a fermenüéből 9 1-t egy 700 literes, 450 1 tápközeget tartalmazó fermentorba viszünk. A tápközeg összetétele a következő: gll D-glükóz 2,8 Maláta dextrin (MD30E) 27,8 Arkasoy 50 13,9 Melasz 1,7 K2HPO4 0,14 Kalcium-karbonát 1,39 Silicone 525 (Dow Corning) (pH-ja sterilizálás előtt 6,5) 0,06 % (térf./térf.) A fermentációt 28 °C-on, keverés és levegőztetés közben végezzük. Kívánt esetben polopropilén 2000-t adagolunk a habzás megakadályozására, és a pH-t kénsav adagolásával 7,2 értékben tartjuk az aratásig. Az aratást 5 nap után végezzük. A 450 1 fermentlét Westfalia KA 25 centrifugával lecentrifugáljuk, és a maradék felülúszót 20 1 vízzel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
