199805. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kondenzált benzazepin-származékok és a vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 199805 B 2 gyületnek a vizsgálat előtt 30 perccel beadott EDso mennyiségével (2,4 mg/kg, p.o.) elért hatással. A hatás időtartamát úgy határozzuk meg, hogy mindkét vagyületből 10 mg/kg-t adtunk (p.o.) be 6 órával a vizsgálat előtt A vegyületet akkor tekintettük aktívnak az injektálást követő hat óra eltelte után, ha még mindig szignifikánsav (p,05) volt képes az elkerülések számát csökkenteni. A vizsgálat azt mutatta, hogy az A vegyület ebben az időben is szignifikánsan csökkentette az elkerülések számát, míg a B vegyület 10 hatástalan volt. Ezeket az eredményeket a II. táblázatban foglaltuk össze, ahol N a vizsgált majmok számát jelenti. II. TÁBLÁZAT Kezelés Dózis N Az elkerülések átlagos száma (± szisztematikus hiba) a kezelés után 6 órával Hordozó-7 59,1 +0,9 A vegyület 10 7 23,9 + 7,5 B vegyület 10 3 59,7 + 0,3 Kompetitiv gátlás vizsgálata Sok vegyületről, amely idegszövetekben képes reprodukálható fiziológiai változásokat előidézni, azt tartják, hogy a hatás egy vagy több receptor helyen való kötődés következtében jön létre. Azok a vegyületek, amelyek in vitro a kiválasztott szerv vagy szerkezet homogenizátumával végzett vizsgálatokban ezekkel a receptor helyekkel szoros kölcsönhatásba lépnek, in vivo adagolva is feltehetően hasonló tulajdonságokat mutatnak, ezért érdemes ezeket, mint potencionálisan gyógyhatású anyagokat vagy diagnosztikumokat tovább vizsgálni. Egy vegyületnek egy receptor helyhez való kötődését in vitro a kötés specifikusságával és a hozzá- 40 férhető helyek telíthetőségével szemléltetjük. A D-l és D-2 receptorokhoz való kötődés jellemzésének módszerét és az adatok értelmezését Billard és munkatársai írták le [Life Sciences 35, 1885 (1984)], és közelebbről az (R)-(+)-8-klór-2,3,4,5-tetrahidro-3-metil-5-fenil- lH-3-benzazepin-7-ol-hemimaleátnak (Sch 23390) a dopamin D-l receptorhoz való kötődését jellemezték. A D-2 receptorokhoz való kötődéséhez képest a D-l receptorokhoz való szelektív kötődés szerintük terápiás előnyökre utal, mivel a D-2 receptor elfoglalása kellemetlen és potenciálisan megfordíthatatlan idegi mellékhatásokkal jár. Triciált Sch 23390-t és triciált spiperont (potenciális D-2 ligand) állítottunk elő a fentebb idézett Billard 5 cikkben leírtak szerint, és sorozathigítást készítettünk 7,4 pH-jú 0,05 mólos trisz-pufferrel. A találmány szerinti vegyületeket a leírásban ismertetett módon állítottuk elő és szükség szerint 7,4 pH-jú, 0,05 mólos trisz-pufferrel hígítottuk. 200-250 g-os hím Sprague-Dawley patkányokat (Charles River Breedging Laboraties, Mass) használtunk az agyszövet előállításához. A patkányokat kíméletesen megöltük és az agyukat eltávolítottuk és jégre tettük. A corpus striatum szövetet kimetszettük, 15 megtisztítottuk, és 100 térfogat jéghideg, 50 mmólos és 7,4 pH-jú trisz-pufferrel 25 ‘C-on homogenizáltunk (Brinkman polytron, 10 mp). A homogenizátumot 10 percig 20000 x g-n centrifugáltuk. Az elkülönült anyagot 120 mM nátrium- kloridot, 5 mM kálium- 20 kloridot, 2 mM kalcium-kloridot és 1 mM magnézium-kloridot tartalmazó 50 mM-es és 7,4 pH-jú trisz- pufferben újra szuszpendáltunk. Polipropilén inkubációs csőbe a vizsgálandó vegyületnek 100 pl 7,4-es pH-jú, 0,05 m-os, 4 mg/ml 25 metil-cellulózt tartalmazó trisz-pufferrel készült oldatát vagy szuszpenzióját, 3H- Sch-23390 trisz-pufferben készült 100 pl oldatát (végső koncentráció 0,3 nM) vagy 3H-spiperon trisz-pufferrel készült 100 pl oldatát (végső koncentráció 0,2 nm) és 800 pl szövetszusz- 30 penziót (kb. 3 mg/vizsgálat) mértünk. A csöveket 37 ‘C-on 15 percig inkubáltunk és azután Whatman GF/B szűrőn vákuum segítségével gyorsan szűrtük, majd négy alkalommal 4-4 ml jéghideg 7,4-es pH-jú, 50 mM-os trisz-pufferrel öblítettük. A szűrőket szcin- 35 tillációs fiolákba helyeztük, 10 ml szcintillánssal (Scintosol, Isolab. Inc.) 25 'C-on 16 óra alatt egyensúlyba hoztuk, és folyadékszcintillációs számlálóval meghatároztuk a rádioaktivitását. A Ki értékeket Billard és munkatársai leírásának megfelelően, a ICso Ki = -------------------1 + [L]/Kd összefüggés alapján határoztuk meg, amelyben IC50 a vizsgált szemek az a mennyisége, amely a 45 specifikusan kötődött 3H-Sch 23390 50 %-át képes helyettesíteni, [L] a vizsgálathoz használt radioligand koncentrációja és Kd a disszociációs állandó. A találmány szerinti vegyületekre meghatározott gátlási állandókat (Ki) az I. táblázat 6. és 7. oszlopban 50 tüntettük fel. I. TÁBLÁZAT Oszlopok: 1 2 3 4 5 6 7 8 Q n a 7a és 7b hidrogének sztereokémiája X Y Ki (mM) 3H-23390 3H-Spip CAR(MED) ch2 1 cisz CH3O OH 6450 > 100,000 CH2 1 cisz HO CH3O 44,800 > 100,000 ch2 1 transz CH3O OH 23 2500 30(po); 0,3-1 (se) ch2 1 transz HO CH3O 2970 > 100,000 ch2 1 transz Cl OH 5,5 11,500 30(po); 0,3(sc) ch2 1 7b(S):7a(R)(+) Cl OH 1800 > 100,000 >30(po) 5
