199785. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pirrolidin-2-(1,3-dikarbonil)-származékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

HU 199785 B

2

Pld. R7

R8

Ry

[a]24D(CH2Cl2)

’H-NMR (CDCI3); 8 (ppm)

37

(a) képletű csoport

C6H5-CH2-O-21,7”

(c=0,552)

7,4-7,2 (m,5H);

6,42-6,4 (2s,2H);

5,2-4,9 (m,2H); 5,1-4,6 (m,2H); 3,85, 3,83,

3,80 (3s,9H) 3,9-3,3 (m,8H); 2,8-1,8 (m,16H)

A prolil-endopeptidáz aktivtás in vitro vizsgálatához prolii- endopeptidázt állítunk elő, úgy, hogy patkány agyi szövet extraktum 1 tömegegységét 5 15 térfogatrész puffer eleggyel (50 mmól/1 nátrium-foszfát puffer (pH=7,2), 1 mmól/1 EDTA és 2 mmól/1 ditiotreitol) Ultraturrax homogenizálóban 4°C hőmérsékleten homogenizáljuk. Az extraktumot 60 percen keresztül 100000 g mellett centrifugáljuk és a 20 kapott felülúszót alkalmazzuk az enzimaktivitás meghatározásához.

A prolil-endopeptidáz aktivitást fluorometriás módszerrel (Kató és munkatársai: J. Neurochem. 35, 527-535 (1980)) mérjük. A mérés alapelve, hogy 25 meghatározzuk a 7-(N-szukcinil-glicil-prolil)-4- metil-kumarin-amid (szukcinil-Gly-Pro-MCA) fluorogén szubsztrátum enzimatikus hasításával felszabadított

7-amino-4-metil-kumarin (7-AMC) fluoresszenciáját.

A vizsgált elegy Össztérfogat 200 pl) 124 pl 50 30 mmól/1 nátrium-foszfát puffért (pH=6,8), 1 mmól/1 EDTA-t, 2 mmól/1 ditiotreitolt tartalmazó elegyből,

6 pl enzim oldatbóűl és 20 pl hatóanyag oldatból áll. Ezt 2 percen keresztül 37” hőmérsékleten inkubáljuk, majd 50 pl 2 mmól/1 szubsztrátum oldat 35 hozzáadásával indítjuk az enzimreakciót. A reakcióelegyet 10 percen keresztül vízfürdőben rázva 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, végül a reakciót 2 ml 1 mól/1 nátrium-acetát pufferrel (pH=4,0) leállítjuk. Azonos körülmények között hatóanyag nélküli, de egyéb 40 szemponból azonos összetételű kontroll mintát készítünk. Az inkubációs elegy háttér fluoresszenciájának meghatározásához az elegyhez acetát puffert adunk a szubsztrátum előtt. Az oldatok fluoresszenciáját Perkin Elmer LS-3 fluoresszensz spektrométeren 370 45 nm gerjesztő hullámhosszal 435 nm-nél mérjük.

A vizsgált hatóanyagok gátló hatását IC50 értékben fejezzük ki, amely a prolil-endopeptidáz aktivitás 50%-os csökkentéséhez szükséges moláris koncentrációnak felel meg. Az IC50 értékeket grafikusan 50 határoztuk meg a 4-5 különböző koncentrációnál három párhuzamos alapján felvett logaritmikus koncentráció/hatás görbéről.

Hatóanyag példaszáma

IC50 (nM)

55

1.

4,5

2.

0,0006

9.

3,8

10.

2,2

60

11.

12

12.

10

13.

0,5

17.

32

18.

20

65

Hatóanyag példaszáma

IC50 (nM)

20.

6

21.

0,9

23.

1,4

24.

0,65

25.

0,4

26.

0,4

27.

0,05

28.

2,6

29.

3,0

30.

2,2

31.

1,1

32.

22

33.

0,9

34.

0,8

35.

5,5

36.

5,5

37.

0,7

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (I) általános képletű pirrolidin-2-(l,3-dikarbonil)- származékok előállítására, a képletben R1 jelentése fenilcsoport,

R2 jelentése hidrogénatom vagy adott esetben 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztiuált fenilcsoport, R3 és R4 együtt egy trimetiléncsoportot képeznek, R5 jelentése hidrogénatom,

R6 jelentése 1-4 szénatomos alkoxicsioport vagy - NR7R8 általános képletű csoport, ahol R7 jelentése hidrogénatom és R8 jelentése alkilrészében 1-5 szénatomos fenilalkil- csoport, dialkil-amiorészében egyenként 1-4 szénatomos és alkilrészében 1-5 szénatomos dialkilamino-alkil-csoport vagy alkilrészében 1-4 szénatomos piridil-alkil-csoport vagy

R7 és R8 a kapcsolódó nitrtogénatommal együtt pirrolidinocsoportot, morfolinocsoportot, pikolilcsoportot, alkilrészében 1-4 szénatomos N-alkil-piperazinocsoportot vagy alkil-részeiben 1-4 szénatomos N-(trialkoxi-fenil)-alkil- piperazinocsportot képeznek, X jelentése oxigénatom, m értéke 0, 1, 2, 3 vagy 4, s értéke 0 vagy 1, n értéke 0 vagy 1,

azzal jellemezve, hogy (IV) általános képletű vegyületet, a képletben

R1, R2, R2, R4, R5, R6, X, m, n, és s jelentése a tárgyi körben megadott előnyösen dimetil- szulfoxiddal oxidálunk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános

8