199691. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfatidil-inozit előállítására biológiai anyagokból
HU 199691 B lás mellett 10 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázist gélkromatográfiás eljárással kezeljük, Toyapearl H W 65 szorbensen választjuk el. A fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és vákuumbepárlóban bepároljuk. A visszamaradó anyagot 50 ml dietil-éterrel kezeljük a lipidszenynyeződések eltávolítására. A terméket 5 ml metanollal extraháljuk. így 20%-os hozammal 0,01 g terméket nyerünk. 4. Példa 10 g árpakorpát pH=7,0-es, 0,005 mól/literes, vizes kálium-klorid-oldattal eldörzsöljük. A kapott homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A sejtmentes vizes sóoldat-fázist az oldat 1 ml-ére számított 50 pm papainnal kezeljük 4 órán át. Az összetapadt fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett végzett centrifugálással 10 perc alatt kiülepítjük. A csapadékot a lipidszennyezések eltávolítására 50 ml dietil-éterrel öblítjük át, majd a mosott csapadékot 5 ml 2:1 arányú metanol:kloroform eleggyel extraháljuk. Ily módon 50%-os hozammal 0,05 g terméket nyerünk. 5. Példa 10 g rízsszemet megőrlünk, majd pH=7- -es, 0,05 mól/literes, vizes nátrium-klorid-oldattal homogenizáljuk. A kapott homogenizátumot 3000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázist elkülönítjük és az oldat 1 ml-ére számított 50 pg tripszinnel kezeljük. Az összetapadt fehérje-foszf atidil-inozit-komplex részecskéket papírszűrőn kiszűrjük. A szűrőn lévő csapadékot 50 ml petroléterrel öblítjük a lipidszennyeződések eltávolítására. A csapadékot ezután 5 ml metanollal extraháljuk. így 90%-os hozammal 0,7 g terméket nyerünk. 6. Példa 10 g rízsmagkorpát 0,05 mól/literes vizes trisz-hidroxi-amino-metán-foszfát-oldattal porcelánmozsárban homogenizáljuk. A kapott homogenizátumot 30 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A sejtmentes vizes sóoldat-fázist az oldat minden ml-ére számítva 50 pg kimotripszinnel kezeljük 8 órán át. Az összetapadt fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig végzett centrifugálással kiülepítjük. A csapadékot 50 ml dietil-éterrel keverjük a lipidszennyeződések eltávolítására. A csapadékot ezután 5 ml metanollal extraháljuk. így 18%-os hozammal 0,02 g terméket nyerünk. 7. Példa 10 g búzakorpát pH=8,5-ös, 0,1 mól/literes vizes trisz-hidroxi-amino-metán-szulfáttal 10 percig homogenizálunk. A kapott homo-7 genizátumot 50 pm pórüsátmérőjű szűrőn átszűrjük. Az elkülönített sejtmentes vizes sóoldat-fázist az oldat 1 ml-ére számított 50 pg papainnal kezeljük 4 órán át. Az összetapadt fehérje-foszfatidil-inozit-komplex részecskéket 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig végzett centrifugálással kiülepítjük. A kapott csapadékot 20 ml dietil-éterrel mossuk a lipidszennyeződések eltávolítására. A csapadékot ezután 2 ml metanollal extraháljúk. így 85%-os hozammal 0,07 g terméket nyerünk. 8 8. Példa 10 g búzakorpát pH=8,5-ös, 0,05 mól/literes, vizes trisz-hidroxi-amino-metán-triklorid-oldattal eldörzsölünk. A kapott homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. A kapott sejtmentes vizes sóoldat-fázist az oldat 1 ml-ére számított 50 pg papainnal kezeljük 8 órán át. Az összetapadt fehérjefoszfatidil-inozit-komplex részecskéket 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig végzett centrifugálással ülepítjük ki. A csapadékot 50 ml dietil-éterrel mossuk a lipidszennyeződések eltávolítására, majd 5 ml metanollal extraháljuk. így 95%-os hozammal 0,11 g terméket nyerünk. 9. Példa 10 g búzakorpát pH=7-es, 0,05 mól/literes, vizes nátrium-klorid-oldatban homogenizáljuk homogenizátorban. A kapott homogenizátumot 10 000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percig centrifugáljuk. Az így nyert sejtmentes vizes sóoldat-fázist 0,2 pm pórusátmérőjű ultraszűrőn engedjük át. A csapadékot a szűrőről eltávolítjuk és 50 ml dietil-éterrel mossuk a lipidszennyeződések eltávolítására. Ezután a csapadékot 2 ml metanollal extraháljuk. így 63%-os hozammal 0,06 g terméket nyerünk. Az ismertetett találmány a kémiai iparban, a biotechnológiában és a gyógyászatban realizálható. Az 1—9 példák termékét vékonyrétegkromatográfiás eljárással szilikagél lemezen vizsgáljuk. Az alábbi, foszfolipidek elválasztására alkalmas oldószerrendszereket alkalmazzuk: 1 ) kloroform, metanol és 7 n ammónia 35:60:5 térfogatarányú elegye és 2) kloroform, metanol, ecetsav és víz 50:25:8: :4 térfogatarányú elegye. Mindkét oldószerrendszerben minden termék vizsgálatakor egyetlen foszfolipid-folt észlelhető, amely a foszfatidil-inozitnak felel meg. Az 1) oldószerrendszerben a foszfatidil-inozit R/ értéke 0,31, a 2) oldószerrendszerben 0,71. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
